МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Утверждаю И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ Зам. руководителя РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамента ветеринарии (Минсельхозпрод России) В.В.Селиверстов ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ 25.11.99г. № 13-4-2/1795 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по определению уровня естественной резистентности и оценке иммунного статуса рыб 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Естественная резистентность рыб - это врожденная способность организма противостоять агрессивному влиянию патогенных факторов биотической и абиотической природы, в том числе, возбудителям инфекционных и инвазионных болезней и продуктов их жизнедеятельности (экзо- и эндотоксинам). Иммунный статус - это структурно-функциональное состояние иммунной системы в конкретный момент жизни особи. Иммунная система рыб представляет собой совокупность кле- точных и гуморальных факторов иммунитета и состоит из клеток лимфоидно- макрофагального комплекса (лимфоцитов, гранулоцитов, клеток Купфера, Лангерганса и т.д.) и гуморальных компонентов (иммуноглобулины, система компонентов комплемента, лизоцим, С-реактивные белки, интерферон, лизины, гемолизины, гемагглютинины и т.п.). Клеточные элементы иммунной системы организованы в тканевые и органные структуры. К ним относятся: тимус, селезенка, печень, лимфоидная ткань головного и туловищного отделов почек, скопления лимфоидной ткани черепной коробки, кишечника, перикарда, Лейдигова и эпигональных органов. Лейдигов и эпигональные органы встречаются только у хрящевых, а скопления лимфоидно-миелоидной ткани в черепной коробке - у хрящевых и костных ганоидов. Значительная часть иммунокомпетентных клеток является составной частью крови и лимфы. Иммунная система рыб отличается от таковой высших позвоночных отсутствием лимфатических узлов, костного мозга и фабрициевой сумки (как это имеет место у птиц); иммуноглобулины у рыб представлены только IgM подобными антителами, тогда как у теплокровных - 5 классами (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE). Для оценки естественной резистентности организмов рыб к заразным болезням, используют разнообразные методические приемы анализа структурно-функционального состояния иммунной системы. Они основаны на регистрации показателей специфических и неспецифических факторов клеточного и гуморального иммунитета. 2. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ИММУНИТЕТА. Неспецифические факторы иммунитета участвуют в реализации функций защиты организма рыб от чужеродных тел, независимо от специфических факторов, являются естественными или врожденными компонентами организма рыб и не возникают вновь при встрече с чужеродными телами. В зависимости от структурной организации их компонентов подразделяются на клеточные и гуморальные. 2.1. КЛЕТОЧНЫЕ ФАКТОРЫ В организме рыб они представлены разнообразными по структурной организации клетками: лейкоцитами, макрофагами, эндотелиоцитами и т.д. Одной из основных функций этих клеток является фагоцитоз. Кроме того, они участвуют в синтезе медиаторов иммунного ответа и антибиотических веществ: лизоцима, интерферона, агглютининов, интерлейкинов и др. 2.1.1. ЛЕЙКОЦИТЫ Лейкоциты рыб представлены разнообразными по структуре и характеру выполняемой функции клетками: лимфоцитами, моноцитами, нейтрофилами, эозино- и базофилами. В основном, лейкоциты рыб, в отличие от высших позвоночных, представлены лимфоцитами, тогда как у теплокровных - клетками нейтрофильного ряда. У рыб на долю лимфоцитов приходится 45-99 % клеток от общего числа лейкоцитов, а у высших позвоночных-25-30%. В 1 мл крови рыб лейкоцитов содержится в 5-10 и более раз больше, чем у человека и животных. Количество лейкоцитов и отдельных типов клеток, его составляющих, в организме рыб колеблется и зависит от индивидуальных, возрастных особенностей, сезона года, зараженности их паразитами, присутствия в воде токсических факторов и условий содержания. На воздействие благоприятных и неблагоприятных факторов рыбы реагируют интенсивностью лейкопоэза и изменением соотношения между лимфоцитами и гранулоцитами. В организме рыб, подвергнутых воздействию "агрессивных" факторов, увеличивается доля содержания клеток гранулоцитарного ряда (палочкоядерных, сегментоядерных нейтрофилов и эозинофилов и аберрантных форм клеток). Изменения в составе лейкоцитов отражаются на степени сопротивляемости рыб к инфекционным и инвазионным болезням. Снижение содержания лимфоцитов отражается на интенсивности синтеза антител, отторжения трансплантата, завершенности фагоцитоза и напряженности иммунитета к болезням. Существуют прямой и непрямой способы учета общего числа лейкоцитов в крови рыб. Исследования проводят в соответствии с "Методическими указаниями по проведению гематологического обследования рыб", утвержденными Департаментом ветеринарии 02.02.99 г., № 13-4-2/1738. 2.1.2. ФАГОЦИТОЗ. Функциональное состояние фагоцитов в большинстве случаев определяется по фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови или клеток, выделенных из головного, туловищного отделов почек и селезенки. Существуют разнообразные методические приемы количественной оценки фагоцитарной активности лейкоцитов. Одни основаны на подсчете числа фагоцитов с захваченными чужеродными телами под микроскопом, другие - на регистрации интенсивности проявления кислородзависимой антиинфекционной системы в реакции хемилюминесценции или по способности фагоцитов восстанавливать растворимый краситель нитросиний тетразолий в нерастворимый диформазан (НСТ-тест). Определение фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro и in vivo в отношении микроорганизмов основано на учете фагоцитов под световым микроскопом. Хемилюминесцентный метод определения фагоцитарной активности клеток требует специального дорогостоящего оборудования и компьютерной техники. Способ определения фагоцитарной реакции лейкоцитов по НСТ-тесту более трудоемкий, чем основанный на использовании тест- микроорганизмов. Изучение фагоцитарной активности лейкоцитов в отношению микробов в практике лабораторных исследований чаще всего проводится in vitro и in vivo. В качестве тест-микробов рекомендуется использовать грамположительные и грамотрицательные микробы: Staphilococcus aureus, Aeromonas hydrophila и Saccharomyces cerevisiae. 2.1.2.1. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ IN VITRO по Е.А. Коста и М.И. Стенко (1947). - Принцип метода. Указанный метод основан на учете соотношения числа лейкоцитов, участвующих в фагоцитозе, и общего числа клеток белой крови. Оборудование и реактивы: пробирки стерильные; пипетки стерильные на 1,0 мл; пастеровские пипетки стерильные; 0,65%-ный стерильный раствор натрия хлорида; 2%-ньш стерильный раствор натрия цитрата; водяная баня, отрегулированная на 60°С; объект фагоцитоза -одномиллиардная взвесь суточной культуры бактерий A. hydrophila, инактивированных при 60°С в течение 30 минут, приготовленная на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат отрегулированный на 26°С; предметные стекла; шлифованное стекло; набор для окраски мазков крови; метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром 1:1; рабочий раствор красителя азур-эозина; иммерсионное масло; микроскоп. - Материал для исследования, ход определения и учет результатов. В пробирку вносят 0,1 мл 2%-ного стерильного раствора натрия цитрата, 0,2 мл свежевзятой крови от обследуемой рыбы, 0,2 мл объекта фагоцитоза. Взвесь осторожно, но тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 2б°С (для теплолюбивых рыб) и более низкой (для холодолюбивых). Через 15 и 30 минут, 1; 1,5 и 2 часа с момента термостатирования пастеровской пипеткой забирают смесь из пробирки, помещают на предметное стекло и делают мазки, которые фиксируют в течение 10 мин. смесью спирта с эфиром (1:1) или в течение 5 мин. метиловым спиртом. Затем мазки красят в течение 20-40 мин. рабочим раствором азур-эозина. После этого их просматривают под иммерсией (ок.7х об.90). Подсчитывают 100 (иногда 50) лейкоцитов. Захватывающую способность лейкоцитов выражают двумя показателями: процентом фагоцитоза - процентным отношением лейкоцитов, захвативших тест-микробы, к общему числу подсчитанных, и фагоцитарным индексом - количеством тест-микробов, захваченных одним фагоцитирующим лейкоцитом. 2.1.2.2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ in vivo пo Г.Д. ГОНЧАРОВУ (1966). - Принцип метода заключается в исследовании реакции фагоцитоза лейкоцитов в брюшной полости рыб. Анализ фагоцитарной реакции, проводится через 15, 30, 60, 90 и 120 мин, с момента введения микроорганизмов. - Оборудование и реактивы: шприц и инъекционные иглы; 0,65%-ный стерильный раствор натрия хлорида; водяная баня, отрегулированная на 60°С; одномиллиардная взвесь суточной культуры бактерий A. hydrophila, инактивированной при 60°С в течение 30 мин.; термостат, отрегулированный на 26°С; пастеровские пипетки стерильные; предметные стекла; шлифованное стекло; метиловый спирт или смесь этилового спирта с эфиром 1:1; рабочий раствор азур- эозина; иммерсионное масло; микроскоп. Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Рыбам между брюшными плавниками внутрибрюшинно вводят указанное количество инактивированных микробных тел на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида, помещают их в аквариум и через 15 и 30 мин., 1, 1.5 и 2 часа с момента введения объекта фагоцитоза у рыб пастеровской пипеткой отбирают из места укола брюшной экссудат, наносят на предметные стекла и делают мазки. Полученные мазки фиксируют в течение 10 мин, смесью спирта ректификата с эфиром (1:1) или в течение 5 мин. метиловым спиртом. Затем мазки красят в течение 20-40 мин. рабочим раствором азур- эозина и исследуют под микроскопом (ок.7 х об.90). Подсчитывают 100-200 лейкоцитов. Оценку проводят аналогично методу Е.А. Коста и М.И. Стенко. 2.2. ГУМОРАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ К гуморальным факторам иммунитета рыб относят разнообразные по структуре и иммунобиологической функции компоненты, входящие в состав крови, лимфы, тканевых жидкостей, кожной и кишечной слизи: лизоцим, комплемент, агглютинины (естественные антитела), интерферон, лектины, трансферины, лизины, бактериолизины, С-реактивный белок, хитиназа и т.д. Ниже приведены методы определения бактерицидных свойств сыворотки крови (БАСК), комплемента, интерферона и естественных антител или агглютининов, наиболее объективно отражающих функциональное состояние иммунной системы и уровень естественной резистентности рыб. 2.2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ (БАСК) КРОВИ РЫБ БАСК отражает функциональное состояние гуморальных факторов защиты или естественной резистентности. Данный показатель используют при оценке характера течения инфекционного процесса, зараженности рыб паразитами и условий нагула. Для учета величины антимикробных свойств сыворотки крови рекомендуется использовать радиоуглеродный и фотоэлектронефелометрический способы. Поскольку для оценки БАСК радиоуглеродным способом требуется специально приспособленное для этой цели оборудование рекомендуется использовать оптический метод (О.В.Смирнова, Т.А.Кузьмина, 1966), адаптированный для рыб (Микряков и др. 1979; Зимин, 1983). 2.2.1.1. Принцип метода основан на учете характера изменения оптической плотности МПБ или РПБ при росте на нем микробов с добавлением или без добавления испытуемой сыворотки с помощью фотоэлектрического колориметра или спектрофотометра. 2.2.1.2. Оборудование и реактивы: пипетки стерильные на 1,0 мл; МПБ или РПБ стерильный в пробирках по 2,5 и 3,0 мл или по 5,0 и 6,0 мл; сыворотка крови исследуемых рыб; одномиллиардная взвесь суточной культуры вирулентных бактерий A. hydrophila (можно использовать и другие виды микроорганизмов), приготовленная на 0,65%-ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат, отрегулированный на 26°С; ФЭК-56М; пастеровские пипетки, шприцы и инъекционные иглы для взятия крови, стерильные. 2.2.1.3. Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Оценку БАСК проводят в течение 1-5 суток от момента взятия крови. Кровь для получения сыворотки собирают в стерильные пробирки каудоэктомией, отсечением жаберных артерий или из кровеносных сосудов хвостового стебля с помощью пастеровской пипетки или шприца. Полученную кровь отстаивают при комнатной температуре 20-30 минут. После обведения сгустка крови с помощью стерильной пастеровской пипетки пробирки ставят в холодильник на 18-24 часа при + 4° С. Через сутки отделившуюся в пробирках сыворотку пастеровскими пипетками отсасывают и переносят в стерильные пробирки. Далее сыворотку центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 10-15 минут и используют для постановки опыта. В пробирки вносят 2,5 мл МПБ или РПБ и 0,5 мл испытуемой сыворотки, а в три контрольные пробирки - 3,0 мл среды. Затем пастеровской пипеткой во все пробирки добавляют по 2 капли одномиллиардной взвеси суточной культуры тест - бактерий. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, отбирают по 3.0 мл смеси и определяют оптическую плотность на ФЭК. После этого пробы помещают в термостат при 26°С на 3 часа, после чего вновь измеряют оптическую плотность их содержимого. В пробирках с активной сывороткой крови оптическая плотность остается на прежнем уровне или незначительно повышается. При слабой бактерицидной активности сыворотки оптическая плотность среды возрастает за счет накопления в ней размножающихся микробов. В контрольных пробирках оптическая плотность среды возрастает. БАСК выражают через изменения оптической плотности контрольных и подопытных проб, отражающие угнетение роста бактерий в присутствии сыворотки, и рассчитывают по формуле: DЕк - DЕо БАСК (%) = 100 х ------------ D Ек , где DЕк - разность оптической плотности второго и первого измерений в контрольных пробирках; DEo - разность оптической плотности второго и первого измерений оптической плотности в опытных пробирках. 100-коэффициент перевода оптической плотности в %. 2.2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОМПЛЕМЕНТА. В качестве тест-объекта для определения активности комплемента in vitro используют эритроциты барана (по классическому пути) и эритроциты кролика (по альтернативному пути). Активность комплемента обычно выражается в условных единицах. За одну 50 % гемолитическую единицу (СН5о) принимается количество комплемента, необходимое для 50 %-го лизиса эритроцитов. Эта единица является условной, поскольку зависит от концентрации эритроцитов, количества сенсибилизирующих антител (для +2 +2 классического пути), величины ионной силы среды, концентрации Са и Mg pH, времени и температуры реакции. Для каждого вида рыб подбираются оптимальные значения этих показателей. Отношение между количеством взятого комплемента и долей лизированных клеток не является линейным, а выражается сигмовидной кривой, для математического описания которой используется уравнение: 1/n Х=К(у/1-у) ,где: Х - количество комплемента (мл) в реакции; у - степень лизиса, выраженная в долях единицы; К-константа, соответствующая 1СН50 при у=0,5; 1/n-константа (определяет наклон кривой, зависит от условий опыта). При логарифмировании этого уравнения получается функция, удобная для оценки результатов: IgX = lgK+l/n[lg(y/l-y)] Зависимость величины lg Х от величины lg(y/l-y) графически будет представлять прямую линию, по которой можно определить искомую величину К. Зная величину К, легко рассчитать количество СН50, содержащихся в 1 мл неразведенной сыворотки. 2.2.2.1. Определение гемолитической активности комплемента по классическому пути активации (метод Мейера в модификации Yano Т., 1992). - Принцип метода основан на способности комплемента присоединяться к комплексу антиген -антитело (эритроциты барана - гемолизин) и вызывать специфический гемолиз сенсибилизированных эритроцитов. За единицу активности (по Мейеру) комплемента теплокровных принимают такое количество неразведенной сыворотки, которое вызывает 50 % лизис 5х108 оптимально сенсибилизированных эритроцитов барана в желатин - вероналовом 2+ 2+ буфере (pH 7,4), содержащем 0,15 mM Са и 0,5 mМ Mg , в течение 60 мин инкубации при 37° С в объеме 7,5 мл. По Yano Т., в зависимости от вида рыб, инкубацию осуществляют при 20 - 25° С в течение 60-120 мин. в желатин- 2+ 2+ вероналовом буфере (pH 7,3 - 7,4), содержащем 0,5 mM Са и 1 mM Mg в объеме 1,5 мл. Для сенсибилизации эритроцитов используют гемолизин того же (или близкого) вида рыб, что и испытуемый комплемент. -Оборудование и реактивы: спектрофотометр и кюветы с длиной оптического пути 1 см (при использовании приборов с иной длиной оптического пути необходимо определить и использовать в расчетах величину оптической плотности (OD) для заданной концентрации эритроцитов); pH - метр; водяная баня; дозирующие микропипетки на 0,2, 1,2 мл; пробирки (5-10 мл), выдерживающие центрифугирование; рефрижераторная центрифуга; стерильные шприцы; глюкоза; NaCI; дистиллированная вода; Na-5,5,- диэтилбарбитурат (мединал); CaCI2; MgCl2; желатин; IN HC1; ледяная уксусная кислота; ацетат натрия; EDTA; 10 % NаНОз; эритроциты барана в растворе Олсвера (1:1); гемолизин; сыворотка крови рыб (источник комплемента); 0.85% NaCI; маточный раствор солей (CaCl2 х 2H20 - 7.35 г, MgCl2 х 6Н2О - 20.33 г, дистиллированная вода до 100 мл). - Приготовление буферных растворов: - Вероналовый буфер, концентрат, рН 7.3-7.4 (5VB): NaCI - 41,5г, Na- 5,5 - диэтилбарбитурат - 5,1 г, IN HC1 - 17.5 мл, дистиллированная вода - 1 л. 2+ - Желатин-вероналовый буфер (GVB ): желатин - 0,1 г, 5VB - 20 мл, маточный раствор солей - 0,1 мл, дистиллированная вода до 100 мл (хранить при +4°С не более 1 недели). 2+ - Глюкозо-желатин-вероналовый буфер (GGVB ): желатин - 0.1 г, 5VB - 10 мл, глюкоза - 2,5 г, маточный раствор солей - 0,1 мл, 10% NaN3 - 0,2 мл, дистиллированная вода до 100 мл (хранить при +4° С не более 1 недели). - 0,1 М EDTA буфер, рН 7,5: 2,92 г EDTA растворить в 90 мл дистиллированной воды, добавляя концентрированный раствор NaOH, довести рН до 7.5, долить дистиллированной воды до 100 мл. - 0,01 М EDTA-желатин-вероналовый буфер (EDTA - GVB): желатин - 0,1 г, 5 VB - 20 мл, 0,1 М EDTA (рН 7,5) - 10 мл, дистилированная вода до 100 мл ( хранить при +4° С не более 1 недели). - 0,001 М ацетатный буфер, рН 5,0: смешать 3 части 0,1 М уксусной кислоты с 7 частями 0,1 М ацетата натрия, развести в 100 раз, довести рН до 5,0. - Получение гемолизина. - Рыба. Для иммунизации используют неполовозрелую рыбу из благополучного хозяйства. Рыбу предварительно адаптируют и содержат в условиях наиболее оптимальных для каждого вида (температура воды, проточность, аэрация, полноценное кормление). - Приготовление стромы эритроцитов барана. 100 мл крови барана в растворе Олсвера (1:1) центрифугируют при 500-1000 g 10 мин (+ 4° С) и дважды отмывают 200 мл физраствора. Осадок эритроцитов лизируют в 1 л дистиллированной воды, содержащей 0,4 мл ледяной уксусной кислоты, в течение ночи при + 4° С. Центрифугируют, затем осадок стромы промывают 6 раз 0,001 М ацетатным буфером (рН 5,0) и 1 раз физраствором, центрифугируя 20 мин. при 500-1000 g. Осадок тщательно ресуспендируют в 30 мл физраствора. В суспензии определяют содержание азота микрометодом Кьельдаля и доводят концентрацию до 1 мг/мл. - Иммунизация рыб. Рыбу инъецируют в/б суспензией стромы эритроцитов из расчета 0,3-0,5 мг N/кг массы рыбы. Инъекции повторяют многократно (6-8 раз) с интервалом 5 дней. Перед каждой инъекцией (начиная с 4-5) отбирают сыворотки и определяют титр гемолизина. Количество инъекций зависит от титров полученных гемолизинов (определение тетрагемолизина см. ниже). - Отбор антисывороток и условия хранения. Через 5 дней после последней инъекции стерильно отбирают максимальное количество крови. После образования и ретракции сгустка центрифугируют 5 мин при 1500 g. Отбирают сыворотки и 2+ разводят 1:1 GVB инактивируют прогреванием (карповые-20 мин при 50° С, лососевые - 20 мин при 42-45°С), расфасовывают и хранят при -20° С и ниже. - Определение титра гемолизина. Готовят серийные 2-х кратные разведения 2+ антисывороток GVB К 0,5 мл каждого разведения антисыворотки добавляют по 0,1 мл эритроцитов барана (1х109 кл/мл, см. ниже), по 0,4 мл GVB 2+ и по 0,5 мл 2+ комплемента, разведенного GVB 1:20-1:40 (в качестве комплемента используют свежую сыворотку, полученную от интактных рыб того же вида). Смесь инкубируют при 20 - 25° С в зависимости от вида рыб (карповые - 25°С - 60 минут, лососевые - 20° - 120 минут), центрифугируют 5 минут при 1600 g, определяют оптическую плотность (OD541) супернатанта и рассчитывают степень гемолиза. За титр гемолизина принимают разведение, дающее 50 % гемолиз. - Получение и условия хранения комплемента. Комплемент рыб очень термолабилен и быстро инактивируется даже при 0° С (несколько часов), не переносит замораживания при минус 20° С, при минус 35° С активность сохраняется в течение месяца. Кровь после отбора оставляют на 30 мин при комнатной температуре, затем на 1 час при 0°С (лед с водой) для ретракции сгустка, центрифугируют 5 мин при 1500 g (0°...+4° С) и отбирают сыворотки. Сыворотки как источник комплемента используют немедленно, а при необходимости хранят при -80° С или лиофилизируют. - Приготовление суспензии эритроцитов. Эритроциты барана в растворе 2+ Олсвера (1:1) трижды отмывают EDTA-GVB и готовят 5% суспензию в GVB . К 0,1 мл 5 % суспензии эритроцитов добавляют 1,4 мл дистиллированной воды, после лизиса эритроцитов измеряют OD541 против дистиллированной воды. Необходимой концентрации эритроцитов барана 1х109 кл/мл соответствует OD541 0,680 при длине оптического пути 1 см. Если 5 % суспензия не дает необходимого значения OD541, значит ее необходимо развести (если OD541<0,680) или сконцентрировать (если OD541>0,680) во столько раз, во сколько полученное OD541 отличается от 0,680. - Подбор разведения гемолизина для оптимальной сенсибилизации эритроцитов. Готовят серийные двукратные разведения гемолизина (используют гемолизин с 2+ титром 1:1500 и выше) на GVB . Берут 2-4 ряда пробирок. В каждый ряд вносят по 0,1 мл/пробирку приготовленные разведения гемолизина. Во все пробирки добавляют по 0,1 мл суспензии эритроцитов. Встряхивают и инкубируют при 25° С 20 мин. 2+ Готовят несколько разведении комплемента на GVB - на каждый ряд свое разведение. Величина разведения зависит от вида рыб и активности комплемента (1:15 -1:80). В каждую пробирку ряда вносят по 1,3 мл комплемента одного и того же разведения. Инкубируют 60 мин при 25° С (для карпа), 120 мин при 20° С (для лососевых), 120 мин при 25° С (для тиляпии), периодически встряхивая. Центрифугируют 5 мин при 1600 g, определяют OD541 и рассчитывают процент гемолиза супернатанта для каждой пробирки. Для каждого разведения комплемента строят график зависимости процента гемолиза от разведения гемолизина. Выбирают кривую с таким разведением комплемента, при котором максимальный гемолиз составляет 50-70% (т.е. кривая выходит на плато при гемолизе 50-70%). За оптимальное разведение гемолизина принимают максимальное разведение, вызывающее максимальный % гемолиза (выход кривой на плато) и для надежности это разведение уменьшают в 2 раза (например, кривая выходит на плато при разведении гемолизина 1:800, а за оптимальное принимают разведение 1:400). - Приготовление сенсибилизированных эритроцитов. Готовят оптимальное разведение гемолизина в EDTA-GVB. Это разведение медленно добавляют (при постоянном помешивании) к равному объему суспензии эритроцитов (1х109 кл/мл в EDTA-GVB) и инкубируют 30 мин при 25° С. Сенсибилизированные эритроциты отмывают в GGVB24, центрифугируют 5-10 мин при 500g и готовят суспензию 2+ эритроцитов в GGVB с концентрацией 5х108 кл/мл. Концентрацию эритроцитов контролируют, измеряя OD541 лизированных клеток (0,2 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов + 1,3 мл дистиллированной воды дают OD541, равную 0,680). Сенсибилизированные эритроциты хранят при +4° С в течение 1 недели. - Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент 2+ разводят GVB в зависимости от предполагаемой его активности, чтобы попасть в область 50% лизиса (для карпа обычно 1/40 - 1/60, для лососевых - 1/60 - 1/80). Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные объемы разведенного 2+ испытуемого комплемента (0,4; 0,5; 0,6; 0,8; 1,0 мл), GVB доводят объем до 1,3 мл, в каждую пробирку добавляют по 0,2 мл сенсибилизированных эритроцитов. Три пробирки используют для контролей: 1 - контроль эритроцитов на спонтанный лизис (0.2 мл сенсибилизированных эритроцитов + 1,3 мл GVB24+); 2 - 100% лизис эритроцитов (0,2 мл суспензии сенсибилизированных эритроцитов + 1,3 мл дистиллированной воды); 3 - контроль OD541 комплемента (1,0 мл разведенного комплемента + 0,5 мл GVB+2). Пробирки инкубируют, периодически встряхивая (время и температура - оптимальные для каждого вида рыб). Центрифугируют 5 мин при 1600g. Измеряют OD541 супернатанта. Вычисляют степень гемолиза (у) с учетом поправок на контроли. Т.е., от полученного значения OD541 супернатанта каждой опытной пробирки вычитают OD541 контроля эритроцитов и OD541 контроля комплемента (значение OD541 контроля комплемента измеряют только для первой пробирки, в которой максимальный объем комплемента, а для остальных пробирок эта величина уменьшается пропорционально уменьшению объема комплемента). В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/(1 - у) от объема комплемента. При 50% гемолизе у/(1 - у) = 1. Графически находят объем комплемента (К), вызывающий 50% гемолиз, что соответствует 1 гемолитической единице СН50. Количество СН50 в 1 мл (М) рассчитывают по формуле: М = 0.2 N : К, где N - величина, обратная разведению комплемента, 0.2 - коэфф. коррекции, т.к. в используемом варианте объем реакционной смеси в 5 раз меньше (1.5 мл), чем в оригинальном по Мейеру (7.5 мл). Гемолитическая активность комплемента карпа равна 20.0 ± 9.1, радужной форели - 28.0 ± 13.5, тиляпии - 205.1 ±76.б. (T.Yano, 1992). -Определение гемолитической активности комплемента по альтернативному пути активации (пo YanoT., 1992). Для определения активности комплемента по альтернативному пути обычно используют эритроциты кролика, как активатор и тест-объект. Реакцию ведут в присутствии EGTA (хелатный агент для Са2+ чтобы блокировать классический путь активации) и Mg2+. Гемолитическая активность карпа (в отличие от радужной форели, тилапии, аю, порги, желтохвоста, человека, свиньи) возрастает в несколько десятков раз при добавлении в реакционную смесь 0.1 mM Са2+. - Принцип метода основан на способности комплемента активироваться эритроцитами кролика и лизировать их. За единицу активности комплемента (АСН50) принимают такое количество неразведенной сыворотки, которое вызывает 50% лизис 4х107 эритроцитов при 20°С в желатин-вероналовом буфере, содержащем 10mM2+ EGTA и 10mМMg2+ в объеме 0.7 мл; рН и время инкубации различаются в зависимости от вида рыб (радужная форель - рН 7.0, 1.5 часа; карп - рН 7.5, 1.5 часа). - Оборудование и реактивы: оборудование см. п. 2.2.2.1.; глюкоза; дистилированная вода; Na-5,5-диэтилбарбитурат; MgCb+2; IN HC1; EGTA; желатин; NaOH; эритроциты кролика; сыворотка крови рыб (источник комплемента). - Приготовление буферных растворов: -Вероналовый буфер, концентрат (5 VB), см.п.2.2.5.3.1. - 0,1 М EGTA - Mg буфер,: EGTA - 38 г, MgCk х 6 H2O - 20,3 г, NaOH - 7 г, дистилированная вода -1л, доводят рН до 7,5 lN NaOH. - 0,01 М EGTA - Mg желатин-вероналовый буфер (EGTA-Mg-GVB): желатин-0,1 г; 5 VB-20 мл; 0,1 М EGTA-Mg-10 мл; дистилированная вода до 100 мл, доводят рН до 7,5 (для карпа), до 7,0 (для радужной форели). Хранят при +4° С в течение 1 недели. - Приготовление суспензии эритроцитов кролика. Эритроциты кролика в растворе Олсвера (1:1) отмывают трижды в EGTA-Mg-GVB и готовят суспензию с концентрацией 2х108 кл/мл в этом же буфере. Концентрацию эритроцитов контролируют, измеряя OD414 лизированных клеток (к 0,1 мл суспензии эритроцитов добавляют 3,4 мл дистиллированной воды и измеряют OD414 лизата; если полученная величина OD414 отличается от 0,740, то суспензию эритроцитов необходимо развести или сконцентрировать во столько раз во сколько полученное OD414 отличается от 0,740). -Получение и условия хранения комплемента см.п.2.2.2.1. -Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все компоненты реакции смешивают при 0°С (лед с водой). Испытуемый комплемент разводят в EGTA- Mg-GVB в зависимости от вида рыб и предполагаемой активности (для карпа 1/15 - 1/20, радужной форели 1/100- 1/170). Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные объемы разведенного комплемента (0,1; 0,125; 0,160; 0,20; 0,25 мл), доводят общий объем до 0,25 мл EGTA-Mg-GVB и добавляют в каждую пробирку по 0,1 мл суспензии эритроцитов. Три пробирки используют для контролей: 1- контроль эритроцитов на спонтанный лизис (0,25 мл EGTA-Mg-GVB +0,1 мл суспензии эритроцитов); 2-100 % лизис (0,1 мл суспензии эритроцитов + 3,4 мл дистиллированной воды); 3 - контроль комплемента (0,25 мл разведенного комплемента +0,1 мл EGTA-Mg-GVB). Пробирки инкубируют 90 мин. при 20°С (для карпа, радужной форели), периодически встряхивают. В каждую пробирку (кроме 2-го контроля) добавляют по 3,15 мл EGTA-Mg-GVB и центрифугируют 5 мин. при 1600g. Измеряют OD414. Вычисляют степень гемолиза (у) с учетом поправок на контроль эритроцитов и комплемента (см.п.2.2.2.1.). В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/1-у от объема комплемента. При 50 % гемолизе у/(1-у)==1. Графически находят объем комплемента (К), вызывающий 50%-ный гемолиз, что соответствует одной гемолитической единице АСН50. Количество АСН50 в 1 мл (М) рассчитывают по формуле: М = 0,5 N : К, где: N-величина обратная разведению комплемента, 0,5-коэфф. коррекции, т.к. в используемом варианте объем реакционной смеси в 2 раза меньше, чем в оригинальном. По данным Yano Т.,1992, гемолитическая активность комплемента карпа равна 58,9 ± 13,5, радужной форели - 345 ± 108, тиляпии- 574 ± 250, барана - 15,4, морской свинки - 11,9, собаки - 14,4, человека - 18,4. 2.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ИНТЕРФЕРОНА СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ (T.Renault et al. 1991, с дополнением) Разработано несколько методов определения активности интерферона, основанных на его способности ингибировать ЦПД вируса в культуре клеток, снижать число бляшек в ней, подавлять титр вируса и синтез РНК. Титром интерферона считают наибольшее разведение испытуемого материала, уменьшающее на 50% показатель активности вируса в контроле. При исследовании большого количества образцов часто используют микрометод титрования интерферона в культуре клеток. При этом очень важно выбрать соответствующую систему "культура клеток - вирус". Вирус должен иметь высокую чувствительность к интерферону и вызывать в культуре клеток четкие изменения, приводящие к разрушению монослоя. Используют культуру клеток гомологичную интерферону и высоко чувствительную к его защитному действию. Для титрования интерферона лососевых рыб наиболее распространенной является система: RTG-2-IPNV; для карпа - ЕРС- SVCV. В качестве источника интерферона используют сыворотки рыб, в случае исследования мальков -гомогенат тушек рыб. 2.2.3.1. Принцип метода. Спектрофотометрический микрометод титрования интерферона основан на различии оптической плотности интактного клеточного монослоя и монослоя с признаками ЦПД после окрашивания соответствующими красителями. За единицу активности интерферона принимают такое разведение образца, которое защищает 50% клеточного монослоя, то есть оптическая плотность клеточного монослоя, обработанного этим разведением, равна 50% оптической плотности контрольного неинфицированного монослоя. 2.2.3.2. Оборудование и реактивы: фотометр для работы с 96-луночными микропанелями (ридер); дозирующие микропипетки (1-й 8-канальные на 0.2 мл); 96- луночные культуральные микропанели; COz - инкубатор или термостат с эксикатором и со свечкой; инвертированный микроскоп; стерильная фильтровальная бумага; вирус; культура клеток; ростовая и поддерживающая среды, необходимые для выбранной культуры клеток (ростовая среда содержит 10% сыворотки, поддерживающая - 2%); 1%-ный раствор кристаллвиолета в 20% этаноле. 2.2.3.3. Подготовка образцов интерферона к исследованию. Сыворотки получают общепринятым способом. Гомогенат готовят на поддерживающей среде в соотношении 1:4. Центрифугируют 15 мин при 3500g и собирают супернатант. Сыворотки или супернатант освобождают от вируса (если его использовали в качестве индуктора интерферона) одним из способов: прогреванием (время и температура зависят от использованного вируса; VHSV -30 мин при 45° С ); ультрацентрифугированием - 4 часа при lOOOOOg ; низким рН (добавляют НС1 до рН 2,0, выдерживают 24-48 часов при +4° С, восстанавливают рН до 7.0 добавлением NaOH). Если в качестве индуктора использовали дсРНК или другие препараты (но не вирусы), эта процедура исключается. Содержащие интерферон образцы можно хранить при -20° С и ниже. 2.2.3.4. Подготовка рабочей дозы вируса. Вирус накапливают в наиболее чувствительной культуре клеток и титруют методом серийных 10-кратных разведении. Готовят вируссодержащую суспензию в поддерживающей среде с титром 4х103 БОЕ/О.2 мл для системы RTG-2 - IPNV и 100 ТЦЛ,5о/0,2 мл для системы EPC- SVCV. 2.2.3.5. Подготовка суспензии клеток. Суспензию клеток готовят в ростовой среде с такой концентрацией клеток, чтобы через сутки образовался монослой (RTG-2 - 95х103 клеток/О. 1 мл; ЕРС - 80-85х103 клеток/О.1 мл). 2.2.3.6. Техника титрования интерферона. Восьмиканальной микропипеткой готовят 2-кратные разведения образцов интерферона на ростовой среде в 96- луночной микропанели (для каждого разведения используют 3-4 лунки) по 0,1 мл/лунка. Чтобы исключить неспецифическое и токсическое действие образцов, титрование начинают с разведения 1:8, а количество разведении зависит от предполагаемого титра интерферона. Обычно достаточно конечного разведения 1:1024. В качестве контролей используют: 1 - контроль клеток (в 3-4 лунки вносят по 0.1 мл ростовой среды); 2 - контроль на токсичность образца (в 3-4 лунки вносят по 0.1 мл образца, разведенного 1:8); 3 - контроль рабочей дозы вируса (в 6-8 лунок вносят по 0.1 мл ростовой среды). Во все лунки (опытные и контрольные) вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Микропанели закрывают крышкой и помещают в СО2-инкубатор при температуре, оптимальной для роста культуры клеток (20° С для RTG-2, 25° С для ЕРС). При отсутствии СО2 - инкубатора можно использовать эксикатор, в который помещают микропанели, зажигают свечу, закрывают крышку и ставят в термостат с указанной температурой. Для герметизации края крышки эксикатора обмазывают вазелином. Через 18-20 час инкубации микропанели открывают, переворачивают и аккуратно стряхивают, чтобы удалить среду. Края панели промокают стерильной фильтровальной бумагой. Во все подопытные лунки и лунки контроля рабочей дозы вируса вносят по 0.2 мл рабочей дозы вируса. В лунки контролей 1 и 2 вносят по 0,2 мл поддерживающей среды. Микропанели закрывают и помещают в СО2 - инкубатор при температуре, оптимальной для репродукции вируса. Инкубируют до развития ЦПД на 100% в лунках с контролем рабочей дозы вируса. 2.2.3.7. Учет результатов и расчет активности интерферона. Среду из микропанелей удаляют стряхиванием, клетки окрашивают в течение 10 мин 1%-ным раствором кристаллвиолета в 20%-ном этаноле. Краситель удаляют, а клетки промывают 3 раза водой и высушивают. Краситель элюируют 70%-ньш этанолом (0.1 мл/лунку) и определяют OD595. Можно определять оптическую плотность клеток без элюирования, сразу после высушивания. Рассчитывают среднее значение OD59; для лунок с контрольными клетками (ODmax), с рабочей дозой вируса, т.е. при 100% поражении монослоя (ODmin), а также среднее значение 00595 для каждого разведения интерферона. Оптическую плотность образцов при 50% защите клеток определяют по формуле: OD50 = (ODmax - ODmin):2 Количество единиц активности интерферона в 1 мл образца (Аиф ) рассчитывают по формуле: Аиф= 1/V Тn + [(Тn+1- Tn) x (ODn - ODmin - OD50):(ODn - ODn+1)] V - объем образца, 0.1 мл; Тn -величина, обратная разведению образца, дающему больше 50% защиты клеток от инфекции; Тn+1 - величина, обратная разведению образца, дающему меньше 50% защиты клеток; ODn - оптическая плотность образца, защищающего больше 50% клеток; ODn+1 - оптическая плотность образца, защищающего меньше 50% клеток. При отсутствии фотометра долю непораженных клеток в каждой лунке (в процентах) определяют приблизительно, исследуя микропанель под инвертированным микроскопом. Активность интерферона рассчитывают по этой же формуле, подставляя вместо величины оптической плотности долю непораженных клеток (в процентах).
.gif){kind=small}
.gif){kind=small}