ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
И ИЕРСИНИОЗА И МЕРЫ ПО ИХ ПРОФИЛАКТИКЕ.
РЕКОМЕНДАЦИИ.
1.ОБЩИЕ ВОПРОСЫ.
2.ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ.
3.МЕТОДИКА ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ (ГЕТЕРОСПЕЦИФИЧЕСКИХ)
ПОКАЗАНИЙ РА С АНТИГЕНОМ,ОБРАБОТАННЫМ ЭДТА.
4.ПОСТАНОВКА РА.
5.УЧЕТ И ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РА.
6.МЕТОДИКА ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ (ГЕТЕРОСПЕЦИФИЧЕСКИХ)
ПОКАЗАНИЙ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ АЛЛЕРГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ.
7.ПОСТАНОВКА АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ.
8.УЧЕТ И ОЦЕНКА РЕАКЦИИ НА АЛЛЕРГИЧЕСКУЮ ПРОБУ.
9.ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ЛИЗИСА ЛЕЙКОЦИТОВ.
10.ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.
11.БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НА ИЕРСИНИОЗ.
12.СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ИЕРСИНИОЗА.
13.ПРОФИЛАКТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА И ИЕРСИНИОЗА И ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫЕ
МЕРОПРИЯТИЯ.
14.СОСТАВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД.
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РСФСР
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
И ИЕРСИНИОЗА И МЕРЫ ПО ИХ ПРОФИЛАКТИКЕ.
РЕКОМЕНДАЦИИ.
Москва, 1991 год.
При проведении плановых диагностических исследований животных на
бруцеллез в благополучных по этой болезни зонах обычно применяют реакцию
агглютинации (РА) или Роз бенгал пробу (РБП). При этом, особенно в весеннее
время, при исследовании сыворотки крови отдельных незараженных и не вакциро-
ванных против бруцеллеза животных с бруцеллезными антигенами могут быть
получены неспецифические результаты реакций. Обычно появление таких реакций
обусловлено глубокой беременностью, стрессами, прививками против других болезней
или носительством близкородственных в антигенном отношении грамотрицательных
микроорганизмов (пастерелл, сальмонелл, кампилобактерий,иерсиний и др.), а также
рядом других причин. Как правило, уровень выявляемых при этом агглютининов не
превышает 100 МЕ у свиней и овец и 200 МЕ у крупного рогатого скота, за исключением
случаев, когда животные являются носителям микроорганизмов из группы иерсиний,
в частности иерсинии энтероколитика серовара 0:9.
Оценка подобных показаний РА в ранее благополучных по бруцеллезу хозяйстах,
учитывая возможность заноса инфекции и длительного бессимптомного
болезни, затруднена и требует дополнительной расшифровки. В этих целях рекомендуется
использовать комплекс показателей, предусмотренных Инструкцией о мероприятиях по
профилактике и ликвидации бруцеллеза животных, утвержденной бывшим Главным
управлением ветеринарии Госагропрома СССР 10.11.88 г., в том числе:
эпизоотологические данные, проявление клинических признаков болезни, сроки
иммунизации против других болезней, результаты исследований другими методами
(бактериологическим, РДСК, РСК, реакцией аллергии) и повторного (через 15-20 дней)
исследования сывороток крови этих и остальных животных данного стада (отары).
Практический опыт показыват, что комплекс дополнительных исследований в
большинстве случаев позволяет подтвердить или исключить наличие бруцеллезной
инфекции в хозяйстве (на ферме). Однако при этом нередко требуются значительные
затраты рабочей силы, времени и материальных средств на проведение ограничительных
мероприятий и для окончательного уточнения диагноза. В связи с этим быстрое
выявление и искоренение возникшего очага бруцеллезной инфекции, а также недопущение
неоправданного убоя скомпрометированных групп скота при выявлении гетероспецифических
серологических реакций с бруцеллезными диагностикумами имеют большую эпизоотологическую
и экономическую значимость.
В большинстве случаев (за исключением носительства иерсиний вида энтероколитика
серовара 0:9) при выявлении в благополучных хозяйствах животных, реагирующих в реакции
агглютинации в диагностических титрах, неспецифические показания РА можно устранить
путем дополнительного исследования таких сывороток с антигеном, обработанным
двунатриевой солью этилен-диамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА, синоним Трилон Б).
Это позволяет значительно ускорить подтверждение или исключение бруцеллеза в хозяйстве
(на ферме), сохранить здоровых племенных и продуктивных животные предотвратить
затраты на дополнительные исследования по уточнению диагноза и на проведение
ограничительных мероприятий.
Для исключения бруцеллеза в случае носительства иерсиний энтероколитика серовара
0:9 животных исследуют аллергическим методом (пальпебральной или внутрикожной пробой
с бруцеллином ВИЭВ, реакцией лизиса лейкоцитов) и проводят бактериологическое
исследование для выделения возбудителя.
Рекомендации составлены на основании результатов собственных исследований,
обобщения литературных данных, положений действующей инструкции «О мероприятиях
по профилактике и ликвидации бруцеллеза» и включают методики устранения неспецифических
показаний РА, уточнения диагноза на бруцеллез, дифференциации серологических реакций,
обусловленных носительством кишечных иерсиний, и диагностики иерсиниоза у животных.
Предлагаемая в рекомендациях система уточнения диагноза предназначена только для
зон, свободных или оздоровленных от бруцеллеза, и используется на непривитом
бруцеллезными вакцинами поголовье скота при эпизоотологической оценке случаев выявления
единичных животных, серологически реагирующих на бруцеллезные диагностикумы.
ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ
ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ
Бруцеллез относят к хроническим инфекциям с выраженной стационарностью.
Своеобразие энзоотии бруцеллеза состоит в том, что у беременных животных она
проявляется массовыми абортами, а у небеременных часто протекает без клиничес-
ких признаков, в связи с чем начало энзоотии может продолжительное время
оставаться незамеченным.
Обычно развитие инфекционного процесса при бруцеллезе сопровождается обра-
зованием специфических антителу, относящихся к различным классам и подклассам
иммуноглобулинов, и формированием гиперчувствительности замедленного типа.
Однако у части животных, особенно у молодняка, нередко наблюдается длительное
скрытое носительство возбудителя болезни (до 3-4 лет и более). В период беремен-
ности скрытое носительство бруцеллеза у большинства из них проявляется обостре-
нием инфекционного процесса, абортами и появлением диагностических титров антител.
Завоз скрыто больных животных на благополучную ферму вызывает новую вспышку
заболевания.
При первичном заносе возбудителя болезнь, как правило, протекает в острой
форме, проявляясь частыми абортами, ростом количества реагирующих антител при
повторных исследованиях животных через 15-26 дней (в РА с 1:50-1:100 до 1:200-1:800
и выше, в РСК с 1:5 до 1:40). Особенно высокие титры антител наблюдаются у инфици-
рованных животных через 2-3 недели после аборта или нормальных родов. В начале
вспышки заболевания количество антител, положительно реагирующих в РА, значительно
большее, чем в РСК. Массовое выделение антител, реагирующих в РА,-показатель активной
стадии болезни. Преобладание количества реагирующих в РСК антител - признак более
длительного течения бруцеллеза.
В последние годы для диагностики бруцеллеза широко используют реакцию
агглютинации на пластинках с забуференным окрашенным антигеном - Роз бенгал пробу
(РБП). Эта экспресс-реакция проста в постановке и может использоваться в полевых
условиях, но при первичней постановке диагноза на бруцеллез в ранее благополучных
хозяйствах требует подтверждения дополнительными исследованиями сыворотки в РА и РСК.
Реакция длительного связывания комплемента (РДСК)по чувствительности несколько
превосходит РСК и выявляет больше зараженных животных. Это преимущество РДСК полезно
использовать при исследовании животных неблагополучных стад с целью оздоровления, но
не при постановке первичного диагноза на бруцеллез в ранее благополучных хозяйствах
В благополучных по бруцеллезу зонах РДСК особых преимуществ перед РСК не имеет.
Отмечена более высокая чувствительность и специфичность аллергической пробы
на бруцеллез с бруцеллином ВИЭВ. После экспериментального заражения аллергическая
реакция обычно развивается на 15-30-й день и стабильно сохраняется длительное время,
поэтому она часто быват положительной при отрицательных показаниях серологических
реакций. В связи с этим при подозрении на заболевание бруцеллезом на основании
выявления единичных животных, реагирующих на серологические реакции, в ранее благо-
получных стадах для уточнения диагноза целесообразно применение аллергической пробы.
Диагностическая результативность исследований на бруцеллез повывшется при
одновременном испальзовании и получении коррелирующих данных серологического и
аллергического методов исследования подозреваемых в заражении групп скота с учетом
динамики (роста или угасания) показателей при повторных исследованиях.
МЕТОДИКА ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ
(ГЕТЕРОСПЕЦИФИЧЕСКИХ) ПОКАЗНИЙ РА С АНТИГЕНОМ,
ОБРАБОТАННЫМ ЭДТА
Оборудование, материалы и компоненты: штативы серологические, 100-гнездные
(типа Флоринского); пробирки для серологических реакций (типа Флоринского); груп-
повой дозатор Флоринского с набором мерных пипеток на 0,1; 0,2; 0,5; 0,8 куб. см;
пипетки мерные на 1,О; 5,0; 10,0 куб. см; кюветы или тазики эмалированные для
физиологического раствора; сыворотки испытуемые и контрольные (позитивная бруцеллез-
ная и негативная); антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК биофабричного произ-
водства; 0,5 М раствор ЭДТА (Трилон Б) в дистиллированной воде; раствор натрия хлорида.
При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота и лошадей для разведения
сывороток и антигена используют 0,85%-ный, а при исследовании сывороток крови овец,
коз и буйволов - 5%-ный раствор натрия хлорида с добавлением 0,5% фенола.
Для приготовления основного (0,5 М) раствора двунатриевой соли ЭДТА (Трилон Б)
18,615 г препарата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Учитывая, что ЭДТА раст-
воряется при рН 8,0, навеску препарата предварительно суспензируют в 80 мл дистиллирован-
ной воды и затем, под контролем рН-метра или универсальной индикаторной бумажки, добавляют
по каплям концентрированный раствор NаОН до рН 8,0 (при постоянном помешивании). После
полного растворения ЭДТА объем жидкости доводят до 100 мл дистиллированной водой. Полу-
ченный основной раствор ЭДТА хранят в холодильнике при температуре 2-8°С до использования.
ПОСТАНОВКА РА
Непосредственно перед постановкой реакции готовят антиген рабочего разведения (1:10).
Для приготовления 100 мл антигена рабочего разведения в колбе смешивают раствор натрия
хлорида (0,85%-ного или 5%-ного)-88 мл, единого бруцеллезного антигена для РА, РСК,
РДСК - 10 мл, основного (0,5 М) раствора ЭДТА - 2 мл.
Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл не менее чем в четырех разведениях
(в зависимости от титра антител, полученного при исследовании испытуемых сывороток в
обычной постановке РА):
при исследовании сыворотки крови овец, коз и буйволов - 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 и
т. д.;
при исследовании сывороток крупного рогатого скота и лошадей - 1:50, 1:100, 1:200,
1:400 и т. д.
В первой пробирке делают сыворотку основного разведения. Для этого сыворотку крови
крупного рогатого скота и лошадей берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирку и добавляют к
ней 2,4 мл 0,85%-ного раствора натрия хлорида (получают разведение 1:25). Сыворотку
крови овец, коз и буйволов берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл 5%-ного раствора натрия
хлорида (получают разведение 1:12,5). Таким образом делают основное разведение испытуемых
сывороток в пробирках первого ряда штатива.
После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,
четвертого, пятого и т. д. рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора натрия
хлорида. Затем из пробирок первого ряда при помощи мерной пипетки или группового дозатора
Флоринского переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл сыворотки основного
разведения (1:25 или 1:12,5). К пробирках третьего ряда сыворотку смешивают с раствором
натрия хлорида, по 0,5 мл сыворотки этого разбавления переносят в пробирки четвертого
ряда и т. д. Из пробирок последнего ряда по 0,5 мл жидкости удаляют.
После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и последующих рядов
с разведенными сыворотками вносят при помощи мерной пипетки или группового дозатора
Флоринского по 0,5 мл приготовленного антигена. После добавления антигена разведение
сывороток в каждой пробирке удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будут
составлять соотношения 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. или 1:25, 1:50, 1:100 и т. д.
В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят - они служат контролем
качества сыворотки. При наличии в сыворотке хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних
примесей результаты РА не учитывают.
При постановке РА с антигеном, обработанным ЭДТА, одновременно с испытуемыми
сыворотками ставят контроль с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испы-
туемыми, а также с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.
После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками
осторожно встряхивают и помещают в термостат при температуре 37-38°С на 16-20 ч, затем
выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего проводят учет реакции.
УЧЕТ И ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РА
Результаты реакции учитывают визуально и определяют по следующей схеме:
+ + + + (4 креста) -полное просветление жидкости, микробные тела антигена оседают
на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья
и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
+ + + (З креста) -неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик», также
разбивающийся в легком встряхивании на хлопья и комочки (75% агглютинации);
+ + (2 креста) - слабое просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен, при
встряхивании образуются хлопья и комочки (50% агглютинации);
+ (1 крест) -едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встря-
хивании видно небольшое количество хлопьев и комочков (25% агглютинации);
- (знак минус) - при слабом просветлении жидкости или полном отсутствии просветления
образовавшийся осадок на две пробирки в виде «зонтика» или «пунктика» осевших микробов
при встряхивании разбивается полностью, образуя равномерную взвесь.
За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла
агглютинация не менее чем на 2 креста (+ +).
Положительные или сомнительные результаты, полученные при исследовании сывороток
крови животных при обычной постановке РА, считают неспецифическими при получении
отрицательных результатов исследования данных сывороток в РА с антигеном, обработанным
ЭДТА, или при снижении титра антител не менее чем на два разведения. В этих случаях животных
признают здоровыми, а хозяйство (ферму) считают благополучным по бруцеллезу.
В случае, если титр антител при исследовании сывороток крови в РА с антигеном,
обработанным ЭДТА, сохраняется на том же уровне, который был получен при обычной постановке
РА, дальнейшую дифференциацию проводят путем аллергического исследования этих и других
животных данного хозяйства (фермы), а также путем бактериологического исследования с целью
исключения микроорганизмов иерсиния энтероколитика.
МЕТОДИКА ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ (ГЕТЕРОСПЕЦИФИЧЕСКИХ)
ПОКАЗАНИЙ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ АЛЛЕРГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Метод основан на выявлении повышенной чувствительности замедленного типа к специфи-
ческому аллергену у больных бруцеллезом и отсутствии таковой у животных - носителей
кишечных иерсиний.
Оборудование, материалы и компоненты: шприцы для внутрикожных инъекций емкостью 1 мл
или безыгольные инъекторы типа «Пчелка», «Овод»; шприцы инъекционные с бегунком емкостью
2 мл или 5 мл; иглы для внутрикожных инъекций с двумя трубками №0706; иглы инъекционные
№0420-0813; вата белая гигроскопическая; спирт этиловый; кислота борная (3%-ный раствор);
бруцеллин ВИЭВ биофабричного производства.
ПОСТАНОВКА АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ
Стерилизацию шприцев и игл перед и после использонния осуществлют кипячением в течение
30 мин в дистиллированной или кипяченой воде. Безыгольные инъекторы стерилизуют в соответст-
вии с инструкцией по их использованию.
Алюминиевый колпачок флакона с бруцеллином перед применением препарата приоткрывают,
резиновую пробку обрабатывают спиртом, прокалывают инъекционной иглой со шприцом и набирают
необходимое количество аллергена. Для применения пригоден только аллерген без примесей,
плесени, хлопьев, осадка или помутнения, с неистекшим сроком годности и при наличии на
флаконе биофабричной этикетки.
Бруцеллин вводят животным под кожу на 1 см ниже края нижнего века со стороны наружного
угла глаза (пальпебральная проба): крупному рогатому скоту, лошадям и буйволам - в дозе 1 мл,
овцам и козам - в дозе 0,5 мл.
При отсутствии возможности пальпебрального введения бруцеллин вводят в центре одной
из подхвостовых складок в дозах; овцам и козам - 0,2 мл, крупному рогатому скоту, лошадям
и буйволам - 0,3 мл (внутрикожная проба). Свиньям бруцеллин вводят внутрикожно с наружной
стороны ушной раковины ближе к основанию уха в дозе 0,2 мл.
Участок кожи перед инъекцией бруцеллина протирают ватой, смоченной З%-ным раствором
борной кислоты. Инъекционные иглы меняют перед каждым наполнением шприца бруцеллином, а в
промежутках между инъекциями препарата иглу держат в ватном тампоне, смоченном 70-градусным
спиртом.
УЧЕТ И ОЦЕНКА РЕАКЦИИ НА АЛЛЕРГИЧЕСКУЮ ПРОБУ
Реакцию на бруцеллин у крупного рогатого скота, лошадей, буйволов, овец и коз
учитывают один раз через 48 ч, у свиней - 2 раза через 24 и 48 ч после введения препарата
путем осмотра, а при неясно выраженной реакции - пальпацией места инъекции.
У животных, больных бруцеллезом, на месте введения бруцеллина проявляется воспалитель-
ная реакция в виде плотной или тестоватой припухлости, обычно хорошо видимой при осмотре;
у свиней, кроме того, может развиться гиперемия, иногда кровоизлияние в виде темно-красного
пятна в центре отека (положительная реакция).
В случае неясно выраженной реакции пальпируют место введения препарата и сравнивают
с кожей века другого глаза или подхвостовой складки, а у свиней - с кожей основания другого
уха. При обнаружении ясно ощутимой разницы в толщине кожной складки реакцию на бруцеллез
также считают положительной.
У здоровых животных, в том числе носителей кишечных иерсиний, воспалительной реакции
на месте введения бруцеллина не возникает (отрицательная реакция).
ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ЛИЗИСА ЛЕЙКОЦИТОВ
Исследуемую сыворотку крови разливают в две пробирки (опытную и контрольную) по 0,1 мл,
добавляют 0,1 мл гепаринизированной крови здоровой морской свинки и помещают на 2 ч в
термостат при температуре 37 град. С. Затем в опытную пробирку добавляют 0,1 мл бруцеллииа,
а в контрольную - 0,1 мл изотонического раствора NаСl . Производят подсчет количества
лейкоцитов в камере Горяева под микроскопом или с помощью автоматического счетчика клеток
(Пикоскель, Целлоскоп). После этого пробирки помещают на 2 ч в термостат при температуре 37
град. С. После инкубации вновь подсчитывают количество лейкоцитов.
Подсчет лейкоцитов проводят не менее 2-3 раз в каждой пробирке, а затем выводят их
среднее количество. Процентное уменьшение количества лейкоцитов после инкубации в опытной и
контрольной пробирках определяют по формуле:
количество лейкоцитов после инкубации Х 100%
_______________________________________________
количество лейкоцитов до инкубации
Долю лизированных лейкоцитов устанавливют путем вычитания процента оставшихся лейкоцитов
из100%.
Показатель специфического лизиса лейкоцитов (ПСЛ) подсчитывают путем определения разницы
между процентом уменьшения лейкоцитов в опытной пробирке и процентом уменьшения лейкоцитов
в контроле.
Показатель специфического лизиса лейкоцитов оценивается следующим образом: 21% и
более - результат резко положительный, 14-20 - результат положительный, 7-13 - результат
слабо положительный, менее 7% - результат отрицательный.
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ
АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Реагирующих на бруцеллин животных (пальпебральная или внутрикожная проба, реакция
лизиса лейкоцитов) метят, признают больными бруцеллезом, выделяют из стада (отары) и
действуют по Инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза.
При получении группового отрицательного результата аллергического исследования, даже
если у отдельных животных сохраняется положительная РА при исследование сыворотки крови
с антигеном, обработанным ЭДТА, стадо (отару) считают благополучным по бруцеллезу.
Для установления этиологии гетероспецифических серологических реакций проводят
бактериологическое исследование материала от животных.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
НА ИЕРСИНИОЗ
Бактериологическую диагностику иерсиниоза проводят в соответствии с методикой
Г.В. Ющенко (1985).
Оборуювание, материалы и компоненты: холодильник, термостаты, рассчитанные на
температуру на 22 и 37%; предметные стекла; бактериологические пробирки, штативы,
гипериммунные кроличьи антисыворотки к различным сероварам иерсиний; бактериологическая
петля и игла; спиртовка; чашки Петри; градуированные пипетки; забуференный изотонический
раствор (среда подращивания Ющенко), корпускулярный формолантиген; среда Эндо, дифферен-
циально-диагностические среды «пестрого» ряда или системы индикаторные бумажные (СИВ);
1,5%-ный мясо-пептонный агар; бульон из триптического перевара казеина; среда для определения
подвижности; реактив Эрлиха; 10%-ный раствор хлорного железа (FеСl3); тест-реактив для
реакции с метиловым красным; тест-реактив для реакции Фогеса-Проскауэра (состав и методы
приготовления см. в приложении).
Материалом для бактериологического исследования служат пробы фекалий (свежие порции
или ректальные смывы), мочи, молока (из каждой доли вымени после сдаивания первых порций),
содержимое кишечника, лимфатические узлы, кусочки органов вынужденно убитых животных.
Доставленные в ветеринарную лабораторию пробы материала высевают на среду подращивания.
При этом жидый материал (молоко, моча и т. п. ) в количестве 2-3 мл вносят в пробирки со
средой, а кусочки органов, пробы кормов и т. п. в количестве 1-2 г предварительно растирают
в стерильной фарфоровой ступке, суспендируют в 5-7 мл среды подращивания, переносят в
стерильную пробирку и закрывают ватно-марлевой пробкой.
Пробирки с посевами в среде подращивания помещают в холодильник и инкубируют при
температуре 4°С. Через 16-24 ч производят первый пересев на плотную среду Эндо в бактерио-
логических чашках. Последующие высевы делают через каждые 4 суток в течение 20 дней
(если не получено положительных результатов в предыдущих высевах). Посев производят
бактериологической петлей из верхнего слоя среды штрихом с одним-двумя отрывами петли для
получения роста изолированных колоний. Посевы в чашках инкубируют при температуре 22-24 град.
С. Первый просмотр посевов производят через 24 ч. Для иерсиний характерно образование мелких
(росинчатых), округлых, выпуклых, прозрачных колоний. Спустя 36-38 ч инкубации колонии
увеличиваются в размере и приобретают розоватый оттенок.
Учитывая, что характерным свойством микроорганизмов семейства энтеробактерий, к
которому относится и род иерсиния, является отсутствие фермента оксидазы, дальнейшую
идентификацию проводят путем выявления оксидазной активности. Для этого выросшие на агаре
Эндо характерные для иерсиний колонии микроорганизмов пересевают бактериологической петлей
на скошенный плотный мясо-пептонный агар (МПА). Через 18-20 ч инкубации в термостате при
температуре 22-24°С выросшую культуру снимают с агара платиновой петлей или запаянным
концом пастеровской пипетки и эмульгируют в капле свежеприготовленного 1%-ного раствора
тетраметилпарафенилендиамина гидрохлорида на предметном стекле.
Для постановки теста можно также использовать 1%-ный раствор диметилпарафенилдиамина
гидрохлорида или оксидазную индикаторную бумагу (входит в состав СИБ, выпускаемых
предприятием по производству бактерийных препаратов Горьковского НИИЭМ).
При положительной реакции (фермент оксидаза присутствует) эмульсия приобретает красный
цвет, указывающий, что исследуемая культура микроорганизмов не относится к семейству энтеро-
бактерий, и в связи с этим ее дальнейшую идентификацию не проводят.
При отрицательном результате теста на оксидазу готовят мазки из исследуемой культуры,
окрашивают по Граму и микроскопируют. В случае окрашивания микроорганизмов в синий цвет
дальнейшее исследование прекращают. При обнаружении в мазке грамотрицательных микроорганизмов
в виде палочек с закругленными концами длиной от 0,8 до 1,2 мкм и шириной от 0,5 до 0,8 мкм
(следует учитывать, также, что кишечные иерсинии в зависимости от условий культивирования
могут обладать выраженным полиморфизмом) исследуемую культуру пересевают с МПА на 2 пробирки
с полужидким (0,3%-ным) мясо-пептонным агаром (МПЖА) для определения подвижности микроба и
способности к продуцированию сероводорода. Параллельно проводят посев на среду с мочевиной
(по Преусу или Кристенсену) для определения уреазной активности.
Для определения подвижности микроорганизмов культуру, выращенную при температуре 22-24°С
и 37 град. С, микроскопируют в раздавленной капле. Продуцирование сероводорода определяют,
поместив в пробирку с посевом фильтровальную бумагу (1Х10 см), пропитанную насыщенным
раствором уксуснокислого свинца. При выявлении подвижности микроорганизмов, выращенных при
температуре 22-24°С, и неподвижности (ограниченной подвижности) микроорганизмов культуры,
выращенной при температуре 37°С, а также при отрицательной пробе на продуцирование серово-
дорода (отсутствие потемнения бумаги, пропитанной уксуснокислым свинцом, в течение 24 ч
инкубации при температуре 22-24°С или 37 град. С) и положительной уреазной пробе проводят
дифференциацию вида иерсиния энтероколитика от других представителей семейства энтеробак-
терий. Для этого исследуемые культуры высевают на среды «пестрого» ряда (см. приложение),
включающие: цитратный агар Симонса, или СИБ; среды с лизином, орнитином, фенилаланином;
среду Кларка (для постановки реакции с метиловым красным и пробы Фогес-Проскауэра); среды с
лактозой, мальтозой, рамнозой, сахарозой, сорбитом, рафинозой и глюкозой; бульон из
триптического перевара казеина (для определения образования индола). Посевы инкубируют при
температуре 22-24 град. С.
Через 24 ч инкубации в пробирку с посевом на бульоне из триптического перевара казеина
добавляют (по стенке пробирки) 2-3 капли реактива Эрлиха или реактива Ковача. Образование
в поверхностной части среды окрашенного в розовый цвет кольца указывает на наличие индола
(положительная реакция).
В этот же срок в пробирку с посевом на среде с фенилаланином добавляют (по каплям)
10%-ный раствор хлорного железа (FеСl3). Окрашивание поверхности среды в интенсивный синий
цвет свидетельствует о расщеплении фенилаланина (положительная реакция).
Для определения степени ферментации глюкозы в одну из пробирок с культурой, выращенной
на среде Кларка, на 4-е сутки добавляют 5-6 капель индикатора метилового красного. При
положительной реакции среда окрашивается в ярко-красный цвет. Пожелтение среды указывает на
отсутствие ферментации глюкозы (отрицательная реакция).
Во вторую пробирку, с целью определения наличия ацетилметилкарбинола (промежуточный
продукт расщепления глюкозы), поочередно добавляют 1 мл а-нафтола (реактив №1) и 0,4 мл
40%-ного раствора едкого кали (реактив №2). Пробирку энергично встряхивают и учитывают ре-
зультат. При положительной реакции среда окрашивается в красный цвет.
Учет ферментации углеводов и расщепления аминокислот в посевах «пестрого» ряда ведут
в течение 7 суток. При этом окрашивание сред с углеводами в розово-малиновый цвет, а сред
с аминокислотами - в фиолетовый указывает на положительную реакцию.
На цитратной среде Симонса развиваются только бактерии, утилизирующие цитрат, при
этом среда приобретает ярко-синию окраску.
Идентификацию изучаемых культур осуществляют по показателям, представленным в
таблицах 1 (определение рода бактерий) и 2 (определение вида иерсиний).
.gif)
.gif)