Пробирки инкубируют, периодически встряхивая (время и температура -
оптимальные для каждого вида рыб). Центрифугируют 5 мин при 1600g. Измеряют
OD541 супернатанта. Вычисляют степень гемолиза (у) с учетом поправок на
контроли. Т.е. от полученного значения OD.,41 супернатанта каждой опытной
пробирки вычитают OD.s4i контроля эритроцитов и ODs4i контроля комплемента
(значение ODs^i контроля комплемента измеряют только для первой пробирки, в
которой максимальный объем комплемента, а для остальных пробирок эта
величина уменьшается пропорционально уменьшению объема комплемента).

В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/(1 - у) от объема
комплемента. При 50% гемолизе у/(1 - у) = 1. Графически находят объем
комплемента (К), вызывающий 50% гемолиз, что соответствует 1 гемолитической
единице CHso Количество СН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:
М = 0.2 N : К, где:
N - величина, обратная разведению комплемента;
0.2 - коэфф. коррекции, т.к. в используемом варианте объем реакционной
смеси в 5 раз меньше (1.5 мл), чем в оригинальном по Мейсру (7.5 мл).
Гемолитическая активность комплемента карпа равна 20.0 ± 9.1, радужной
форели - 28.0 ± 13.5, тиляпии - 205.1 ± 76.6. (T.Yano, 1992).

2.2.2.2. Определение гемолитической активности комплемента по
альтернативному пути активации (по Yano Т., 1992).

Для определения активности комплемента по альтернативному пути обычно
используют эритроциты кролика, как активатор и тест-объект. Реакцию ведут в
присутствии EGTA (хелатньш агент для Са2^ чтобы блокировать классический
путь активации) и Mg2+.

Гемолитическая активность карпа (в отличие от радужной форели, тиляпии,
аю, порги, ' желтохвоста, человека, свиньи) возрастает в несколько десятков раз
при добавлении в реакционную смесь 0.1 mM Ca2^
- Принцип метода основан на способности комплемента активироваться
эритроцитами кролика и лизировать их.
За единицу активности комплемента (АСН5о) принимают такое количество
неразведенной сыворотки, которое вызывает 50% лизис 4х10 эритроцитов при
20°С в желатин-вероналовом буфере, содержащем 10mМ EGTA и 10mM Mg^ в
объеме 0.7 мл; рН и время инкубации различаются в зависимости от вида рыб
(радужная форель - рН 7.0, 1.5 часа;
карп - рН 7.5, 1.5 часа).
- Оборудование и реактивы; оборудование см. п. 2.2.2.1.; глюкоза;
дистилированная вода; Ма-5,5-диэтилбарбитурат; MgCl2+2; IN HC1;
EGTA; желатин; NaOH; эритроциты кролика; сыворотка крови рыб (источник
комплемента).
- Приготовление буферных растворов:
- Всроналовый буфер, концентрат (5 VB), см.п, 2.2.2.1.
- 0,1 М EGTA - Mg буфер,: EGTA - 38 r, MgC12 x 6 Н20 - 20,3 г, NaOH – 7
r, дистилированная вода - 1л, доводят рН до 7,5 IN NaOH.
- 0,01 М EGTA - Mg желатин-вероналовый буфер (EGTA-Mg-GVB):
жедатин-0,1 г; 5 VB-20 мл; 0,1 М EGTA-Mg-10 мл; дистилированная вода до 100
мл, доводят рН до 7,5 (для карпа), до 7,0 (для радужной форели). Хранят при +4° С
в течение 1 недели.
- Приготовление суспензии эритроцитов кролика. Эритроциты кролика в
растворе Олсвера (1:1) отмывают трижды в EGTA-Mg-GVB и готовят суспензию с
концентрацией 2х108 кл/мл в этом же буфере. Концентрацию эритроцитов
контролируют, измеряя ODw лизированных клеток (к 0,1 мл суспензии
эритроцитов добавляют 3,4 мл дистиллированной воды и измеряют OD4i4 лизата;
если полученная величина OD4i4 отличается от 0,740, то суспензию эритроцитов
необходимо развести или сконцентрировать во столько раз во сколько полученное
00414 отличается от 0,740).
-Получение и условия хранения комплемента см.п.2.2.2.1.
-Техника постановки реакции и расчет активности комплемента. Все
компоненты реакции смешивают при 0° С (лед с водой). Испытуемый комплемент
разводят в EGTA-Mg-GVB в зависимости от вида рыб и предполагаемой
активности (для карпа 1/15 - 1/20, радужной форели 1/100 -1/170).
Берут ряд из 8 пробирок. В 5 пробирок вносят разные-объемы разведенного
комплемента (0,1; 0,125; 0,160; 0,20; 0,25 мл), доводят общий объем до 0,25 мл
EGTA-Mg-GVB и добавляют в каждую пробирку по 0,1 мл суспензии эритроцитов.
Три пробирки используют для контролей: 1-контроль эритроцитов на спонтанный
лизис (0,25 мл EGTA-Mg-GVB + 0,1 мл суспензии эритроцитов); 2 - 100 % лизис
(0,1 мл суспензии эритроцитов + 3,4 мл дистиллированной воды); 3 - контроль
комплемента (0,25 мл разведенного комплемента + 0,1 мл EGTA-Mg-GVB).
Пробирки инкубируют 90 мин при 20° С (для карпа, радужной форели),
периодически встряхивают.

В каждую пробирку (кроме 2-го контроля) добавляют по 3,15 мл EGTA-Mg-
GVB и центрифугируют 5 мин. при 1600g. Измеряют OD4i4. Вычисляют степень
гемолиза (у) с учетом поправок на контроль эритроцитов и комплемента
(см.п.2.2.2.1.). В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/1-у от
объема комплемента. При 50 % гемолизе у/(1-у)=1. Графически находят объем
комплемента (К), вызывающий 50 %-ньш гсмолиз, что соответствует одной
гемолитической единице АСН5и.
Количество АСН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:
М = 0,5 N : К, где:
N-величина обратная разведению комплемента, 0,5- коэфф. коррекции, т.к. в
используемом варианте объем реакционной смеси в 2 раза меньше, чем в
оригинальном. По данным Yano Т., 1992, гемолитическая активность комплемента
карпа равна 58,9 j: 13,5, радужной форели - 345 +_ 108, тидяпии- 574 j: 250, барана
- 15,4, морской свинки - 11,9, собаки -14,4, человека -18,4.

2.2.3. Определение активности иптерферона спектрофотометри-ческим
методом (T.Renault et al. 1991, с дополнением)

Разработано несколько методов определения активности интерфе-рона,
основанных на его способности ингибировать ЦПД вируса в культуре клеток,
снижать число бляшек в ней, подавлять титр вируса и синтез РНК. Титром
интерферона считают наибольшее разведение испытуемого материала,
уменьшающее на 50% показатель активности вируса в контроле. При
исследовании большого количества образцов часто используют микрометод
титрования интерферона в культуре клеток. При этом очень важно выбрать
соответствующую систему "культура клеток - вирус". Вирус должен иметь
высокую чувствительность к интерферону и вызывать в культуре клеток четкие
изменения, приводящие к разрушению монослоя. Используют культуру клеток
гомологичную интерферону и высоко чувствительную к его защитному действию.
Для титрования интерферона лососевых рыб наиболее распространенной является
система: RTG-2-IPNV; ддя карпа - ЕРС- SVCV. В качестве источника интерферона
используют сыворотки рыб, в случае исследования мальков - го-могенат тушек
рыб.

2.2.3.1. Принцип метода. Спектрофотометрический микрометод титрования
интерферона основан на различии оптической плотности ин-тактного клеточного
монослоя и монослоя с признаками ЦПД после окрашивания соответствующими
красителями. За единицу активности интерферона принимают такое разведение
образца, которое защищает 50% клеточного монослоя, то есть оптическая
плотность клеточного монослоя, обработанного этим разведением, равна 50%
оптической плотности контрольного неинфицированного монослоя.

2.2.3.2. Оборудование и реактивы: фотометр для работы с 96-луночными
микропанелями (ридер); дозирующие микропипетки (1- и 8-канальные на 0,2 мл);
96-луночные культуральные микропанели; СС>2 - инкубатор или термостат с
эксикатором и со свечкой; инвертированный микроскоп; стерильная

фильтровальная бумага; вирус; культура клеток; ростовая и поддерживающая
среды, необходимые для выбранной культуры клеток (ростовая среда содержит
10% сыворотки, поддерживающая - 2%); 1%-ный раствор кристаллвиолета в 20%
этанояе.

2.2.3.3. Подготовка образцов интерферона к исследованию. Сыворотки
получают общепринятым способом. Гомогенат готовят на поддерживающей среде
в соотношении 1:4. Центрифугируют 15 мин при 3500g и собирают супернатант.
Сыворотки или супернатант освобождают от вируса (если его использовали в
качестве индуктора интерферона) одним из" способов: прогреванием (время и
температура зависят от использованного вируса; VHSV - 30 мин при 45° С );
ультрацентрифугированием - 4 часа при lOOOOOg ; низким рН (добавляют НС1
до рН 2,0, выдерживают 24-48 часов при +4° С, восстанавливают рН до 7.0 добав-
лением NaOH).

Если в качестве индуктора использовали дсРНК или другие препараты (но не
вирусы), эта процедура исключается. Содержащие интерфе-рон образцы можно
хранить при -20° С и ниже.

2.2.3.4. Подготовка рабочей дозы вируса. Вирус накапливают в наиболее
чувствительной культуре клеток и титруют методом серийных 10-кратных
разведении. Готовят вируссодержащую суспензию в поддерживающей среде с
титром 4х103 БОЕ/0.2 мл для системы RTG-2 - IPNV и 100 ТЦД5о/0,2 мл для
системы EPC-SVCV.

2.2.3.5. Подготовка суспензии клеток. Суспензию клеток готовят в ростовой
среде с такой концентрацией клеток, чтобы через сутки образовался монослой
(RTG-2 - 95х103 клеток/О. 1 мл; ЕРС - 80-85х103 клеток/О. 1 мл).

2.2.3.6. Техника титрования ингерферона. Восьмиканальной микропипеткой
готовят 2-кратные разведения образцов интерферона на ростовой среде в 96-
луночной микропанели (для каждого разведения используют 3-4 лунки) по 0,1
мл/лунка. Чтобы исключить неспецифическое и токсическое действие образцов,
титрование начинают с разведения 1:8, а количество разведении зависит от
предполагаемого титра интерферона. Обычно достаточно конечного разведения
1:1024.

В качестве контролей используют: 1 - контроль клеток (в 3-4 лунки вносят по
0.1 мл ростовой среды); 2 - контроль на токсичность образца (в 3-4 лунки вносят
по 0.1 мл образца, разведенного 1:8); 3 - контроль рабочей дозы вируса (в 6-8
лунок вносят по 0.1 мл ростовой среды).
Во все лунки (опытные и контрольные) вносят по 0,1 мл суспензии клеток.
Микропанели закрывают крышкой и помещают в СОг-инкубатор при температуре,
оптимальной для роста культуры клеток (20° С для RTG-2, 25° С для ЕРС). При
отсутствии СО; - инкубатора можно использовать эксикатор, в который помещают
микропанели, зажигают свечу, закрывают крышку и ставят в термостат с
указанной температурой. Для герметизации края крышки эксикатора обмазывают
вазелином.
Через 18-20 час инкубации микропансли открывают, переворачивают и
аккуратно стряхивают, чтобы удалить среду. Края панели промокают стерильной
фильтровальной бумагой.
Во все подопытные лунки и лунки контроля рабочей дозы вируса вносят по
0.2 мл рабочей дозы вируса. В лунки контролей 1 и 2 вносят по 0,2 мл
поддерживающей среды.
Микропанели закрывают и помещают в СО-г - инкубатор при температуре,
оптимальной для репродукции вируса. Инкубируют до развития ЦПД на 100% в
лунках с контролем рабочей дозы вируса.

2.2.3.7. Учет результатов и расчет активности интерферона.

Среду из микропанслсй удаляют стряхиванием, клетки окрашивают в
течение 10 мин 1%-нь1м раствором кристаллвиолета в 20%-ном этаноле.
Краситель удаляют, а клетки промывают 3 раза водой и высушивают.
Краситель элюируют 70%-ным этанолом (0.1 мл/лунку) и определяют OD595.
Можно определять оптическую плотность клеток без элюиро-вания, сразу после
высушивания. Рассчитывают среднее значение OD595, для лунок с контрольными
клетками (ODmax), с рабочей дозой вируса, т.е. при 100% поражении монослоя
(ODmin), а также среднее значение OD595 для каждого разведения интерферона.
Оптическую плотность образцов при 50% защите клеток определяют по
формуле:
OD5o = (ODmax - ODmin):2

Количество единиц активности интерферона в 1 мл образца (Аиф )
рассчитывают по формуле:
Аиф= 1/VTn + [(Т n+1 - Tn) x (ODn - ODmin - OD5o):(ODn - ODn+1
V - объем образца, 0.1 мл;
T,i -величина, обратная разведению образца, дающему больше 50% защиты
клеток от инфекции;
Т пн - величина, обратная разведению образца, дающему меньше 50%
защиты клеток;
ODn - оптическая плотность образца, защищающего больше 50% клеток;
OD,n+1 - оптическая плотность образца, защищающего меньше 50% клеток.

При отсутствии фотометра долю непораженных клеток в каждой лунке (в
процентах) определяют приблизительно, исследуя микропанель под
инвертированным микроскопом. Активность интерферона рассчитывают по этой
же формуле, подставлял вместо величины оптической плотности долю
непораженных клеток (в процентах).
3. Специфическая иммунная система
Специфическая иммунная система состоит из клеточных и гуморальных
компонентов. От неспецифических факторов они отличаются специфичностью
взаимодействия с чужеродными агентами. Специфичность иммунных реакции
определяется лимфоцитами и иммуноглобули-нами.
Состояние специфического звена иммунной системы рыб важно знать при
оценке иммунного статуса, определении потенциальных возможностей организма
рыб противостоять воздействию агрессивных факторов среды и установлении
характера влияния иммуномоду пирующих к вакцинных средств. Оно оценивается
по данным анализа клеточных и гуморальных факторов иммунитета.

3.1. Клеточные факторы
Основную роль в формировании специфического клеточного иммунного
ответа рыб на чужеродные агенты играют лимфоциты.

3.1.1. Лимфоциты

3.1.1.1. Метод определения абсолютного и относительного содержания
лимфоцитов основан на установлении относительного числа лимфоцитов в
процентах по лейкоцитарной формуле и проведении расчета содержания клеток,
приходящихся на долю лимфоцитов из общего количества лейкоцитов,
обнаруженных в 1 мл крови при прямом подсчете.

3.1.1.2. Определение Т- и В-лимфоцитов.

Существуют разнообразные способы определения Т- и В-лимфоцитов в
организме рыб. Они основаны на учете характера реагирования лимфоцитов с
маркерами или со специфическими антисыворотками против отдельных
клеточных популяций. В качестве маркеров используют эритроциты барана,
мышей, зимозан, Т и В-зависимые митоге-ны (конкавалин А, фитогсмагглютинин,
липополисахариды, птичий туберкулин) и т.д. Для оценки качественного состава и
количества отдельных типов клеток применяются методы розеткообразования или
реакция бластрансформации.
•   Определение   содержания   Т-лимфоцитов   методом   Е-
розеткообразования.
Принцип метода. Т-лимфоциты в организме позвоночных, в т.ч. рыб,
выполняют разнообразные функции, связанные с распознаванием "своего" и
"чужого" и поддержанием генетического постоянства внутренней среды. Данный
показатель используется при оценке состояния Т-клеточного иммунитета. Т-
лимфоциты несут на своей поверхности рецепторы для эритроцитов барана (ЭБ).
Благодаря наличию таких рсцепторов Т-лимфоциты способны вступать в реакцию
с эритроцитами барана и образовывать так называемые розетки. Подсчитав
количество Е-розеткообразующих клеток, судят о количественном содержании
(относительном и абсолютном) Т-лимфоцитов в исследуемом образце.

Оборудование, реагенты и реактивы: 0,5 %-ная суспензия эритроцитов
барана; раствор Олсвера; фосфатный буфер (рН-7,4); раствор Хсн-кса (или среда
199); 3 %-ный раствор глутарового альдегида; метиловый зеленый; пиронин;
хлороформ; лимфоциты; фикол-верографин (плотностью -1,007 г/мл);
силиконизированные или пластиковые пробирки; центрифуга настольная;
пипетки, пробирки центрифужные; гспарин; кровь рыб; микроскоп; камера
Горяева.

  Материалы для исследования, ход определения и учет результатов.
Из крови рыб выделяют лимфоциты путем центрифугирования в градиенте
фикол-верографина. В силиконизированную пробирку, смоченную раствором
гепарина (или цитрата натрия), набирают 1 -2 мл крови рыб, разводят 1:1
раствором Хснкса; на дно сухой пробирки аккуратно наливают 1,5-2 мл градиента
плотности; наклонив пробирку под углом 45°; пробирки цснтри4)угируют при i500
об/мин в течение 40 минут; после центрифугирования пипеткой собирают кольцо
лимфоцитов, находящееся между слоями плазмы и градиентом плотности; клетки
дважды отмывают раствором Хенкса при 1500 об/мин в течение 10 минут; под-
считывают концентрацию лимфоцитов в камере Горяева и доводят раствором
Хенкса (или средой 199) до 2 млн. кл/мл. - трижды отмытые эритроциты барана
разводят средой 199 до 0,5% концентрации. В силиконизированную пробирку
объемом 1-2 мл вносят 0,1 мл 0,5% раствора эритроцитов барана, к эритроцитам
барана добавляют 0,1 мл суспензии лимфоцитов (2 млн. кл/мл), смесь инкубируют
5 мин при 26° С, после инкубации смесь центрифугируют в течение 5 мин при 750
об/мин и инкубируют при 26° С в течение 1 часа. По истечении инкубации клетки
фиксируют глутаровым альдегидом (0,05 мл 3% раствора) и после отмы-вания от
глутарового альдегида делают мазки. Мазки фиксируют в метаноле. красят метил-
грюн-пиронином по Брашс и микроскопируют. Число Н-розеткообразующих
клеток в процентах вычисляют в результате подсчета 200-300 лимфоцитов в
препарате. За розеткообразуюшую клетку (РОК) принимают лимфоцит,
присоединивший нс менее 3 эритроцитов барана. Абсолютные цифры Е-
розеткообразующих клеток в 1 мкл выводят на основании количества лимфоцитов
в 1 мкл крови. Лимфоциты можно выделить из суспензии клеток селезенки,
лимфоидной ткани про-и мезонефроса и тимуса.
• Определение Т-, В-, Д-И 0-лимфоцитов (по Мэндес, 1973).
Принцип метода. При смешивании лимфоидных клеток рыб с эритроцитами
барана (ЭБ), частичками зимозана, сенсибилизированными макроглобулиновыми
антителами с комплементом, происходит их избирательная адсорбция
лимфоидными клетками: на Т-лимфоцитах адсорбируются эритроциты барана, на
В-лимфоцитах - частицы зимозана, на Д-лимфоцитах - частицы зимозана и
эритроциты барана; 0-лимфоциты остаются свободными от эритроцитов и
частичек зимозана. Данный метод применяется для идентификации
популяционной структуры лимфоцитов.

Компоненты, материалы и оборудование. Лф - суспензия лим-({юцитов рыб,
концентрацией 2 млн. клеток/мл, в среде 199 (или Хснкса). Способ получения Лф
(см. выше). ЭБ - 0,5%-ная взвесь эритроцитов барана - индикаторы для Т-
лимфоцитов; частицы зимозана конъюгирован-ньге с комплементом (индикаторы
для В-лимфоцитов). Разбавители: физ-раствор, среда 199. Материалы и
оборудование: гепарин, хлористый аммоний, 0,2%-ный раствор трипановой сини,
глутаральдсгид,разделяющий раствор с плотностью 1,077 г/мл,
силиконизированныс цснтрифужные и другие пробирки, пипетки, счетные камеры
Горяева или Бюркера, холодильник, фазовоконтрастный микроскоп.

Техника постановки реакции. В силиконизированную пробирку приливают
по 0,1 мл взвеси лимфоцитов, 0,5%-ной взвеси эритроцитов барана и частички
зимозана с комплементом. Смесь клеток инкубируют 5 мин при 26°С,
центрифугируют 5 мин при 800-1000 об/мин и вновь инкубируют при 12° С - 60
мин. Осадок осторожно ресуспендируют, наносят каплю взвеси клеток на
предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Из капли
взвеси можно готовить мазки на предметных стеклах и покрасить их но
Романовскому-Гимза.

Учет и оценка результатов реакции осуществляются одновременно и
параллельно в световом и фазово-контрастном микроскопах. Просматривают 200
лимфоцитов и определяют процент РОК. Т-лимфоцит образует розетку из 3 и
более ЭБ, В-лимфоцит - из 3 и более частиц зимозана;
Д-лимфоцит образует смешанную розетку - 2 ЭБ + 2 и более частиц зимозана; 0-
лимфоцит розеток не образует.

3.2. Гуморальные факторы

3.2.1. Илшуноглобулины. Они являются биохимической основой
специфического гуморального иммунитета, выполняют функцию специфических
антител к конкретным антигенам, синтезируются плазматическими клетками (В-
лимфоцитами) и секретируются в кровь или тканевые жидкости. Основная их
часть относится к гамма - глобулиновой фракции сыворотки крови.

Методы определения содержания в организме рыб иммуноглобули-нов
основаны на оценке содержания гамма-глобулинов в сыворотке крови или других
биологических жидкостях. Простыми и доступными приемами исследования
гамма-глобулинов в сыворотке крови и других жидкостях являются методы
электрофореза, хроматографии на анио-нообменниках, осаждения насыщенными
растворами фосфатов или сульфатов. Существуют также иммунологические
методы определения содержания гамма-глобулинов у рыб с помощью
антисывороток.
" Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови рыб по гамма-
глобулину методом осаждения.

Принцип метода. При взаимодействия с насыщенными растворами
фосфатов, определенной концентрации гамма - глобулины осаждаются. изменяя
тем самым оптическую плотность исследуемого образца. Определение
производится параллельно с другими фракциями сыворотки крови (альбуминами,
альфа и бета-глобулинами), по изменению оптической плотности (ОП) на ФЭКе.

Оборудование и реактивы. ФЭК, химические пробирки, пипетки на !. 2, 5, 10
мл, бюретка на 100 мл, мерные колбы на 100 и 500 мл, холодильник, сыворотка
крови, фосфатные растворы (основной и рабочий), штативы для пробирок.

Материал для исследования, ход определения и учет результатов. Вначале
готовят основной фосфатный раствор: 335 г гидроокиси натрия растворяют в 400
мл дистиллированной воды, добавляют 226,8 г фосфорнокислого калия
однозамещснното. После растворения охлаждают до комнатной температуры и
добавляют дистиллированную воду до объема 500 мл, затем готовят рабочие
фосфатные растворы для осаждения каждой (фракции белков. Берут 4 мерных
колбы на 100 мл, которые нумеруют соответственно N 1, 2, 3 и 4. В каждую колбу
вносят строго определенное количество основного фос4)атного раствора: 92,4 мл -
N 1, 74,9 мл - N 2. 58,8 мл - N 3, 48,7 мл - N 4 и до метки 100 мл доливают
дистиллированную воду. После этого рабочие растворы в колбах тщательно разме-
шивают путем встряхивания (при хранении добавляют I каплю хлороформа на 100
мл раствора). После приготовления (фосфатных растворов приступают к
определению белковых фракций в исследуемых образцах. На каждую пробу
сыворотки крови берут 6 пробирок и нумеруют: 0. 1, 2, 3, 4, 5. В пробирку под
цифрой 0 вносятся 10 мл дистиллированной воды, в пробирки под номерами 1, 2, 3
и 4 - по 5 мл соответствующих этим цифрам рабочих фосфатных растворов. В
пробирку N5 вносят 0.5 мл исследуемой сыворотки крови, 0.75 мл
дистиллированной воды и 3.75 мл основного фосфатного раствора, пробирку
закрывают пробкой и перемешивают путем перевертывания ее 5-6 раз, после чего
из этой пробирки переносят по 0.5 мл смеси в пробирки N I, 2, 3, 4 и 1 мл в
пробирку под номером 0 (контроль).
Содержимое пробирок тщательно и осторожно перемешивают, избегая
образования пены и пузырьков воздуха и выдерживают 15 мин при комнатной
температуре. По истечении указанного срока осуществляют измерение ОГГ
растворов в пробирках N 1, 2, 3, 4 против контроля (N 0) на ФЭКс при красном
светофильтре в кювете с длинной оптического пути 1 см.
Определение оптической плотности проводится сначала в пробирке N4,
затем в пробирках N 3, 2 и 1.
Расчет результатов   производится по схеме:
ОП пробирки N1 - ОП пробирки N2 = ОП альбуминов;
ОП пробирки N2 - ОП пробирки N3 = ОП альфа-глобулинов;
ОП пробирки N3 - ОП пробирки N4 = ОП бета-глобулинов;
ОП пробирки N4 = ОПгамма-глобулинов.

Принимая сумму ОП альбуминов и всех глобулиновых 4>ракций за 100%
(ОП пробирки N1), вычисляют долю содержания каждой фракции в процентах.
Процентное содержание гамма-глобулинов определяют по (формуле:
Относительное содержание гамма-глобулина, % = ОПкк х 1 ()(). где:
ЮП
Ongg - гамма-глобулина (ОП - пробирки N 4), ?0n - сумма ОП всех белковых
фракций (ОП пробирки N 1), 100 - коэффициент перевода содержания гамма-
глобулина в %. Зная концентрацию общего белка в единице объема можно
произвести перерасчет в абсолютные величины. Ошибка метода составляет + 4%.

          3.2.2. Антитела
Антитела представляют собой сывороточные белки, синтезируемые В-
лимфоцитами при попадании в организм антигена или чужеродных тел и
вступающие с ними во взаимодействие. Главными свойствами антител являются
специфичность и гетерогенность. Специфичность антител определяется
антигеном, вызывающим их синтез. Рыбы, как и высшие позвоночные,
синтезируют разнообразные по структуре и функции антитела: агглютинины,
преципитины, антитоксины, комплементсвязывающие и вируснейтрализующие
антитела, гемолизины, полные и неполные. Антитела по происхождению
подразделяются на естественные и индуцируемые (образующиеся после
парентерального и энтерального введения антигена). Они являются одной из
информационных структур иммунной системы, выполняющих функцию
иммунологической памяти об антигене. Благодаря высокой специфичности
антитела используются при определении природы антигенов, вызывающих их
синтез, напряженности активно приобретенного иммунитета, характера течения
процесса иммуногенеза и характера влияния благоприятных и неблагоприятных
факторов на иммунную систему рыб.
Существуют многочисленные методы определения содержания антител в
организме рыб: серологические, иммуноэлектрофоретические, радиоиммунные,
иммуноферментные, иммунодиффузныс, лазерные.
Наиболее простыми и общепринятыми методами определения антител в
организме рыб являются: реакция агглютинации, реакция агглютинации дате кс-
антигена (или антител).

3.2.2.1.. Определение антител в реакции агглютинации,
Реакция агглютинации (РА) используется для идентификации возбудителя
болезни с помощью стандартной (референтной) агглютинирующей сыворотки.
Агглютинацией называется склеивание микробов агглютининами сыворотки в
присутствии электролитов, т.е. солевых растворов.

Принцип метода основан на установлении способности сыворотки крови
иммунных рыб склеивать микроорганизмы, вызвавшие этот иммунный ответ.

Оборудование и реактивы: пробирки стерильные; 0,65%-ный стерильный
раствор натрия хлорида; сыворотка крови обследуемых рыб; водяная баня,
отрегулированная на 60° С; одномиллиардная взвесь суточной культуры
инактивированных микроорганизмов возбудителей болезни рыб, приготовленная
на 0.65%- ном стерильном растворе натрия хлорида; термостат, отрегулированный
на 26° С; агглютиноскоп; пастеровские пипетки, пробирки, шприцы и
инъекционные иглы для взятия крови - стерильные.