Материал для исследования, ход определения ч учет. результатов.
В штатив размещают ряд из 8 или более пробирок. В первую вносят 0.2 мл
сыворотки, в остальные - такой же объем 0.65%-ного стерильного раствора натрия
хлорида. Во вторую пробирку к разбавителю добавляют 0-2 мл цельной сыворотки
и тщательно перемешивают содержимое пробирки пилотированием. Стандартный
объем (0.2 мл) смеси переносят в следующую (третью) пробирку, тщательно
смешивают с разбавителем и переносят в четвертую, и так далее до предпоследней
пробирки рядя, из которой стандартный объем смеси удаляют. В результате
получают серию разведении, в которой содержание исходной сыворотки (и
соответственно антител) убывает в геометрической прогрессии 1:2, 1:4, 1:8 и т.д.
до 1:64 и более. После внесения 0,2 мл жидкости в очередную пробирку пипетку
заменяют на новую.
В пробирки с разведенной сывороткой (кроме первой - контроль сыворотки)
и в последнюю пробирку с физраствором (контроль антигена) вносят по 0.05 мл (1
капля) тест-антигена, тщательно перемешивают до получения равномерной взвеси
и помещают в термостат на 2-3 часа при 26°С. Контролем служат сыворотка и
антиген без сыворотки (первая и последняя пробирки ряда). Штатив с пробирками
вынимают из термостата и проводят предварительную оценку реакции, затем
оставляют при комнатной температуре на 20-24 часа. Окончательную оценку
реакции осуществляют с помощью агглютиноскопа. Учет реакции проводят по
четырехбалльной системе:
"++++" - полная агглютинация (осадок рыхлый в виде зонтика, жидкость над
осадком прозрачная, при встряхивании видны хлопья или зерна различной
величины);
"+++" - полная агглютинация (осадок такой же, надосадочная жидкость менее
прозрачна);
"++" - неполная агглютинация (осадок небольшой, надосадочная жидкость
непрозрачная);
"+" - следы агглютинации (осадок незначительный, надосадочная жидкость
непрозрачная);
"-" - отрицательная реакция (осадка нет, взвесь равномерно мутная).
В контроле антигена - осадка нет, взвесь равномерно мутная. Наивысшее
разведение исследуемой сыворотки, в которой происходит агглютинация
добавленных микробных клеток при оценке не менее, чем на два креста, считают
ее титром.

3.2.2.2. Реакция агглютинации латекс-антигена (или антител) - РА-ЛАг
(Зингер, Плотц, 1956).

Принцип метода. Реакция агглютинации мслкодисперсных частиц латекса,
нагруженных: антигеном (АГ), под воздействием специфических антител (AT)
иммунной сыворотки или антителами, при взаимодействии с гомологичным АГ,
применяется для обнаружения содержания антител у иммунных рыб к разным АГ
и диагностики возбудителя болезни.

Компоненты и материалы. AT - 5%-ный раствор растворимого антигена (в
качестве источника АГ могут служить гомогенаты аутоантигс-нов, возбудителей
болезни, вакцины, сыворотки крови и т.д.). Исследуемая сыворотка рыб. 10%-ная
суспензия частиц полистиролового латекса стандартной величины-от 0,77 до 0,81
мкм на 0.65% растворе NaCl. Хранят при 2-4° С, но не дольше 4-х недель.
Разбавители: боратныи или глициновый буфер с рН 8,1-8,3. Боратный буфер: 50
мл 0,1 М раствора борной кислоты (6,184 г НзВОз растворяют в 1000 мл диет.
воды), 5,9 мл 0,1%-ного раствора NaOH и 100 мл 0,85%-ного раствора хлорида
натрия. Глициновый буфер: к 1 л 0,1 М раствора глицина, доведенного до рН 8,2 с
помощью 1 н. раствора NaOH, добавляют 10 г NaCL. Материалы:
пипетки, пробирки, колбы и др.

Техника постановки реакции. Дм сенсибилизации частиц латекса к 0,1 мл
10%-ной суспензии мслкодиспсрсных частиц добавляют 0,5 мл 5%-ного раствора
АГ и 9,4 мл боратного буфера. Суспензию тщательно перемешивают и
выдерживают 2 ч при 26°С. Постановку реакции латскс-аплютинации начинают с
приготовления в дополнительном ряду пробирок разведении сыворотки
исследуемых рыб на боратном буфере в соотношениях от 1:10, 1:20 до 1:1280-
1:2560.

Капельная реакция латекс-агглютинации. В ряд микропробирок вносят по 2
капли соответствующих разведении исследуемой сыворотки и добавляют по 1
капле суспензии частиц латекса, сенсибилизированных соответствующим АГ. В
контроле смешивают аналогичные объемы частиц латекса с разведсниями
инактивированной нормальной сыворотки. Штатив с пробирками встряхивают и
выдерживают при 26° С 30 мин. Затем смеси центрифугируют при 1500 об/мин в
течение 3 мин, осторожно встряхивают н учитывают результат реакции.

Пробирочная реакция латекс-агглютинации. В опытный ряд пробирок
приливают по 1 мл соответствующих разведении исследуемой сыворотки и
добавляют по 1 мл латскс-АГ. Контрольные смеси: 1) борат-ньш буфср+суспснзия
латекс-АГ; 2) разведения нормальной сыворотки + суспензия латекс-АГ. Пробирки
встряхивают, помещают в водяную баню при 26°С на 2 ч, центрифугируют при
1500 об/мин в течение 10 мин, осторожно встряхивают и учитывают результат
реакции.

Учет и оценка результатов реакции производятся по образованию зерен
латсксного агглютината и просветлению жидкости в пробирке. Учет результатов
целесообразнее проводить в агглютиноскопе; оценка проводится по 4-балльной
системе.

4. Определение напряженности иммунитета
Под напряженностью иммунитета следует понимать способность организма
рыб противостоять агрессивному влиянию возбудителей болезни и их продуктам
метаболизма и распада (экзо- или эндотоксинам). Напряженность иммунитета
отражает совокупную деятельность всех функциональных структур иммунной
системы рыб на уровне целостного организма.
Одним из объективных способов оценки напряженности иммунитета или
устойчивости рыб к паразитам, вызывающим инфекционные и инвазионные
болезни, является заражение рыб патогенными организмами или их токсинами.
Оценка напряженности иммунитета применяется в селекционной работе, при
определении эффективности вакцинации, последствий влияния благоприятных и
неблагоприятных для жизнедеятельности биотических и абитических (включая
токсические) факторов на выживаемость рыб.

4.1. Методика определения напряженности иммунитета (с ис-
пользованием A.hydrophila)

4.1.1. Принцип метода основан на экспериментальном заражении рыб
вирулентной культурой, вызывающей 50% или 10()%-нуто гибель исследуемого
вида рыб. Причем, в группе рыб с низким уровнем естественной резистентности
LD5o меньше, чем в группе рыб с более высоким уровнем напряженности
естественного иммунитета.

4.1.2. Оборудование и реактивы: аквариумы, пробирки, шприцы, рыба,
суточная культура вирулентных бактерий - возбудителя инфекционной болезни
рыб.

4.1.3. Материал для исследования, ход определения и учет результатов.
Отбирают 60 экз. рыб, имеющих средний для данной партии рыб показатель
навески. В заполненные водой (с температурой не ниже 18°С и не выше 26° С)
пять (и более) аквариумов или бассейнов с аэрацией или садки, установленные в
карантинном пруду, помещают по 25 экз. (из расчета не более 5 г ихтиомассы на 1
л воды) отобранных рыб, которым предварительно вводят внутрибрюшинно
одномиллиардную взвесь суточной вирулентной культуры бактерий A. hydrophila,
приготовленную на 0.65%-ном стерильном растворе натрия хлорида в дозах 0.125;
0.25; 0.5; 0.75; 1 мл (и более). Наблюдение за инфицированной рыбой ведут в
течение 10 суток с момента инъекции микробной взвеси и по вьккивае-мости
устанавливают дозу инфекта, вызывающую 50 или 100%-ную гибель рыб, с
характерными для данной инспекции клиническими и патоло-гоанатомическими
изменениями. Расчет летальной дозы, вызывающей 50%-ную гибель рыб (LD5o),
проводят по методу Рида и Менча (Гончаров, 1973).
Расчитанной дозой LD50 инфекта проводят заражение по 25 экз. исследуемых
рыб, относящихся к одному виду, возрасту, с одинаковой массой, но находящихся
при разных условиях содержания, либо на разных этапах иммуногеиеза, течения
болезни и т.д. Постановку и проведение опыта, а также учет результатов
осуществляют так же, как и при отработке дозы LD5o. Напряженность иммунитета
определяют с учетом процента погибших рыб в опытной группе в сравнении с
контролем.
По окончании аквариумных опытов проводят обеззараживание воды в
аквариумах путем создания в них 10%-ной концентрации формалина или 10%-
ного раствора хлорной извести. Через час воду спускают в канализационную сеть,
а рыб сжигают. Весь инвентарь и посуду, бывшие в употреблении при работе с
больной рыбой, дезинфицируют в 10%-ном растворе формалина в течение часа.
При завершении биологической пробы в бетонированных бассейнах,
земляных садках, карантинных прудах рыбу сжигают и проводят дезинфекцию
воды пугем хлорирования, доводя содержание свободного хлора в воде до 4-5
мг/л. Сутки спустя воду пропускают через известковый фильтр (используют
только свежую негашеную известь). После этого проводят дезинфекцию ложа
прудов или садков и бассейнов негашеной или хлорной известью и оставляют их
без воды на срок не менее месяца.
С утверждением настоящих Методических указаний утрачивают силу Методические
указания по определению уровней естественной резистентности организма рыб (к
инфекционным болезням)", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 13.07.87 №432-3.
 

Приложение 1
к Методическим указаниям по определению уровня
естественной резистентности и оценке
иммунного статуса рыб, утв. 25 ноября 1999 г.
Уровень фагоцитарной активности лейкоцитов карпа на стадии
поглощения, %
 

Возраст рыб, время фагоцитоза с момен- та термостатирова-ния или введения Объекта фагоцитоза		Низкий		Средний		Высокий
		Процент фагоцитоза	Фагоцитарный индекс	Процент фагоцитоза	Фагоцитарный индекс	Процент фагоцитоза	Фаго-цитар-ный индекс
сеголетки	15 мин.	6,0+2,0	-	8,0+2,0	-	10 и более	-
	30 мин.	7,0+2,0	0,3+0,2	9,0+2,0	0,6+0,2	11-"-	0,7 и более
	1 час	17,0+4,0	0,8±0,2	21,0+4,0	0,1+0,2	25 -"-	1,2-"-
	1,5 часа	24,0+5,0	1,3+0,2	29,0+5,0	1,5+0,2	34 -"-	1.7-"-
	2 часа	19,0+5,0	1,4+0,2	24,0+5,0	1,6+0,2	29 -"-	1,8-"-
двухлетки	15 мин.	9.0+3,0		12,0+3,0	-	15 -"-	-
	30 мин.	13,0+5,0	0,3+0,2	18,0+5,0	0,5+0,2	23 -"-	0,7 -"-
	1 час	20,0+7,0	0.9+0,2	27,0+7,0	1,1+0,2	34 -"-	1,3-"-
	1,5 часа	28,0+8,0	1,3+0,2	36,0+6,0	1,5+0,2	44.-"-	1,7-"-
	2 часа	27.0+8,0	1,4+0,2	35,0+8,0	1,6+0,2	43 -"-	1,8-"-
трехлетки	15 мин.	9,0+3,0		12,0+3,0	-	15-"-	-
	30 мин.	14,0+5,0	0,4+0,2	19,0+5,0	0,6+0,2	24 -"-	0,8 -"-
	1 час	24,0+6,0	1,0+0,2	30,0+6,0	1,2+0,2	36 -"-	1,4-"-
	1,5 часа	30,0+S,0	1,2+0,4	38,0+8,0	1,6+0,4	46 -"-	2,0 -"-
	2 часа	28.0+8.0	1,4+0,3	36,0+8,0	1,7+0,3	44 -"-	2,0 -"-
4-8-летки	1 5 мин.	10,0+5,0		15,0+5,0	-	20 -".-	-
	30 мин.	15,0+5,0	0,4+0,2	20,0+5,0	0,6+0,2	25 -"-	0,8 -"-
	1 час	22,0+8,0	1,2+0,2	32,0+8,0	1,2+0,2	40 -"-	1,4-"-
	1,5 часа	30,0+9,0	1,2+0-4	39,0+9,0	1,6+0,4	48 -"-	2,0 -"-
	2 часа	29,0+9,0	1,4+0,3	38,0+9,0	1,7+0,3	47 -"-	2,0-"-