МИНИСТЕРСТВО
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА                                 Утверждаю
   И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                          Заместитель Руководителя
 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)                                              В.В.Селиверстов 

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

№ 13-7-2/1870  от  10.02.2000

   МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ 19-НОР-
    ТЕСТОСТЕРОНА В ОБРАЗЦАХ МЯСА И МОЧИ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
   РИДАСКРИН 19-НОРТЕСТОСТЕРОН (RIDASCREEN® 19-NORTESTOSTERON)
      (производство фирмы Ар-Биофарм/R-Biopharm, Германия)

1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения 19-нортестостерона в мясе и
моче с помощью тест-системы для иммунно-ферментного анализа RIDASCREEN® 19-
Nortestosteron*.

*RIDASCREEN® и RIDA®  являются зарегистрированными товарными знаками 
фирмы R-Biopharm, Германи

2. Краткое описание методики
Пробоподготовка:    Ферментативный гидролиз (только для образцов мочи)
                    Очистка методом твердофазной экстракции
Затраты времени:
Пробоподготовка
(при обработке 10-ти проб)                                 около 1-го часа
Анализ (независимо от количества проб)                     3 часа

Предел обнаружения:
для образцов мяса:                                          0.4 мкг/кг (400 ppt)
для образцов мочи:                                          0.8 мкг/кг (800 ppt)

Сходимость результата анализа:                        коэффициент
                                                                                      вариации
                                                                                     не хуже 10%

Извлекаемость (для образцов мочи):                        85%

Перекрестная чувствительность:

19-нортестостерон 17бетта                                   100.0%
19-нортестостерон 17альфа                                   80.0 %
19-норэтистерон                                                       74.0%
19-норандростендион                                            100.0%
18-метил-19НТ-17бетта                                            59.0%
17альфа-этил-19НТ-17бетта                                    40.0%
15альфа, 16альфа- метилен-19НТ-17бетта-ацетат         71.0 %
диэтилстильбестрол                                                <0.1%
тренболон                                                                 10.0%
зеранол                                                                    <0.1 %
эстрадиол-17бетта                                                   0.1 %
МРА                                                                         <0.1%

3. Общие положения
19-нортестостерон являются синтетическим анаболическим стероидом, обладающим 
также андрогенной активностью.

Использование 19-нортестостерона   в животноводстве и птицеводстве, импорт и
реализация продуктов животного происхождения, содержащих остаточные концентрации 19-
нортестостерона, запрещены в Российской Федерации и в странах Европейского союза (Указание
Главного государственного ветеринарного инспектора от 4.10.99 № 12-7-1/900, Правила по
организации  государственного ветеринарного надзора за содержанием  гормональных
стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения, утвержденные
приказом МИНСЕЛЬХОЗПРОДА России от 18.08.99 № 604, Директивы Евросоюза 89/662/ЕЕС,
90/425/ЕЕС, 96/22/ЕС, 96/23/ЕС и др).

Для определения 19-нортестостерона используются инструментальные физико-
химические методы анализа, такие как жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и 
хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы, однако, предусматривают использование 
дорогостоящего оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании.
В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется более 
удобный иммунно-ферментный метод анализа (ИФА, ELISA), являющийся официальным методом 
контроля продуктов животного происхождения, принятым в странах Евросоюза (Директива 
93/257/ЕЕС).

4. Нормативные ссылки
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила
безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность.
Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств
защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы,
пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения
свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы
определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие
технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные
параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие
требования.

5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами.
Планшет, входящий в состав набора RIDASCREEN® 19-Nortestosteron, сенсибилизирован
овечьими антителами, специфичными к кроличьему иммуноглобулину IgG, который, в свою
очередь, получен путем иммунизации кроликов 19-нортестостероном. Анализ выполняется
следующим образом.

Исследуемые (стандартные) образцы, раствор, содержащий антитела к 19-нортестостерону
(кроличий IgG) и раствор, содержащий коньюгат 19-нортестостерона с ферментом, дозируются в
лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы 19-
нортестостерона, содержащегося в пробе или в стандартном растворе и молекулы коньюгата 19-
нортестостерона с ферментом, конкурируя между собой, связываются антителами к 19-
нортестостерону в объеме раствора. Одновременно происходит иммуносорбция антител к 19-
нортестостерону овечьими антителами на поверхности планшета.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы
коньюгата 19-нортестостерона с ферментом.

После промывки планшета в его лунки дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида)
и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе инкубации, при химическом
взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата,
связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные
продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой
бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом
голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере), обратно
пропорциональна концентрации 19-нортестостерона в исследуемых образцах.

6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1.Предел обнаружения 19-нортестостерона составляет:
•0.8 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
•0.4 мкг/кг в мясе при навеске образца 10г

6.2. Диапазон определяемых концентрация 19-нортестостерона составляет:
•0.8 - 64.8 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
•0.4 - 32.4 мкг/кг в мясе при навеске образца 10г

7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
7.1. Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Меры массы по ГОСТ 7328
рН-метр
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Дозаторы на 20, 50, 100, 200 и 1000 мкл
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 50, 100 и 1000 мл исп. 2 по ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50 и 100 мл по ГОСТ 1770
Пипетки с одной отметкой 2-го класса точности вместимостью 5 мл по ГОСТ 29169
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 5 и 10 мл по ГОСТ 29227
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; цена деления 1°С, пределы измерения 0 - 10О°С
по ГОСТ 29224.

7.2. Вспомогательные устройства
Мясорубка по ГОСТ 4025
Центрифуга с устанавливаемым ускорением 3000 g и возможностью охлаждения
(желательно)
Центрифужная пробирка на 10-15 мл с завинчивающейся крышкой
Устройство для испарения экстрактов, например испарители ротационные типа ИР-1М-2, В-
580, системы TCS, «Эвапорэк» и др. или лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1)
Устройство для перемешивания типа «вортекс»
Устройство для встряхивания проб
Устройство для твердофазной экстракции, например типа «Доркус», «Вакэлют» и др. или
разовый шприц пластиковый объемом 5 мл
Пипетки Пастера

Пробирки П-2-10-14/23, П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Колба коническая со шлифом и притертой пробкой типа КН-1 -50-14/23 по ТУ 92-891.029-91
Стаканы химические вместимостью 50, 100, 250 и 1000 мл по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
Груша резиновая
Холодильник бытовой

7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа RIDASCREEN® 19-Nortestosteron в
стандартной комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8
лунок), сенсибилизированный антителами к кроличьему IgG                      1 шт
Комплект стандартных растворов 19-нортестостерона
в 40% водном растворе метанола со следующими
концентрациями (1 рр1=1нг/кг): 0 ppt (нулевой стандарт),
200 ppt, 600 ppt, 1800 ppt, 5400 ppt, 16200 ppt, по 300 мкл              6 х 1 шт
Коньюгат 19-нортестостерона с пероксидазой,
конц. (красная крышка)                                                       1 шт
Антитела к 19-нортестостерону,
конц. (черная крышка)                                                        1 шт
Субстрат, содержит пероксид карбамида,
7 мл (зеленая крышка)                                                        1 шт
Хромоген, содержит тетраметилбензидин,
7 мл (голубая крышка)                                                        1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты,
14 мл (желтая крышка)                                                        1 шт
Буфер, для разбавления конц. растворов
коньюгата и антител, 25 мл                                                   1 шт

Колонки для твердофазной экстракции марки RIDA® C18*
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Глюкоронидаза/арилсульфатаза из Helix promatia (только при исследованиях проб мочи)
Метилтретбутиловый эфир, (СНз)зСОСНз
(возможна замена метилтретбутилового эфира диэтиловым эфиром)
Метанол, СНзОН
Ортофосфорная кислота, НзРОз, концентрированная
Соляная кислота, HCI, концентрации 1 М
Уксусная кислота, СНзСООН, концентрации 20 % вес.
Ацетат натрия, тригидрат, СНзСООNа х ЗН2O
Трис-(гидроксиметил)-аминометан (трис), (CH2OH)3CNH2
Дигидрофосфат натрия, дигидрат, NaH2PO4 x 2H2O
Гидрофосфат натрия, безводный, Na2HPO4

Замечания по использованию и хранению тест-системы
RIDASCREEN® 19-Nortestosteron

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности
определения.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с
другим номером партии.

Храните набор при температуре 2-8°С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет с
сипикагепем (осушителем) и плотно закройте пакет.

Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны,
избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами.

*Поставляется 000 «СТАЙЛАБ» тел./факс (095) 265-44-05

Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора хромогена не
рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора хромогена
является признаком его порчи.

В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым
стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком порчи реагентов.

8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности
при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по
ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также
требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные
устройства.

8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено
приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с органическими растворителями необходимо проводить
в вытяжном шкафу с использованием резиновых перчаток.

9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего
высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической
лаборатории, владеющего техникой иммунно-ферментного анализа и освоившего метод в
процессе стажировки.

10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

Температура воздуха                         20 ± 5 °С;
Атмосферное давление                        84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздуха                           не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети                           220 ± 10 В;
Частота переменного тока                    50 ± 1 Гц

11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269 и ГОСТ 7702.0 и согласно действующей
нормативной документации.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.

11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию. При отсутствии
такой возможности допускается хранение образцов не более чем 2 суток с момента отбора при
температуре 2 - 8°С, либо 5-6 месяцев при температуре - 20°С.

11.3. Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1. Приготовление раствора фосфорной кислоты концентрации 1М.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 9.8г концентрированной ортофосфорной
кислоты. С помощью стеклянной воронки кислоту переносят в мерную колбу на 100 мл. Стакан
омывают двумя порциями дистиллированной воды по 10 мл. Смывы последовательно переносят в
мерную колбу с кислотой и разбавляют раствор дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

11.3.2. Приготовление ацетатного буферного раствора концентрации 0.05 М, рН 4.8
Навеску 0.68 г тригидрата ацетата натрия переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят
объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до
растворения ацетата натрия и переливают в химический стакан на 250 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят рН до 4.8 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 20 % раствор уксусной
кислоты.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

11.3.3. Приготовление 0.067 М фосфатного буферного раствора, рН 7.2
Взвешивают 7.67 г безводного гидрофосфата натрия, 2.02 г дигидрата дигидрофосфата
натрия и 8.7 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную колбу на 1000 мл и доводят объем
раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до растворения
осадка и переливают в химический стакан на 1000 мл.

С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят рН до 7.2 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя раствор ортофосфорной
кислоты.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

11.3.4. Приготовление 0.02 М фосфатного буферного раствора, рН 7.2
Взвешивают 2.3 г безводного гидрофосфата натрия, 0.62 г дигидрата дигидрофосфата
натрия и 9.0 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную колбу на 1000 мл и доводят объем
раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до растворения
осадка и переливают в химический стакан на 1000 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят рН до 7.2 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя раствор ортофосфорной
кислоты.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

11.3.5. Приготовление 0.02 М буферного раствора трис/метанол (20%), рН 8.5
Навеску 0.242 г трис-(гидроксиметил)-аминометана переносят в мерную колбу на 100 мл и
доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до
растворения осадка и с помощью рН-метра измеряют значение рН. При необходимости доводят рН
до 8.5 ± 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 1М раствор соляной
кислоты. Раствор с установленным значением рН переносят в колбу на 250 мл и смешивают с 25
мл метанола.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

11.3.6. Приготовление 40% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 40 мл метанола и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

11.3.7. Приготовление 80% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 80 мл метанола и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

12. Пробоподготовка
12.1. Пробы мочи
12.1.1. Исследуемая проба мочи объемом 0.5 мл смешивается с 3 мл ацетатного
буферного раствора концентрации 0.05 М (рН 4.8).

12.1.2. С помощью дозатора в смесь вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы и
выдерживают раствор в термостате при температуре 37°С в течение 3-х часов (при отсутствии
термостата допускается выдержка при комнатной температуре в течение одной ночи).

12.1.3. Очистка пробы методом твердофазной экстракции.
12.1.3.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции, руководствуясь инструкцией
по его эксплуатации, промойте колонку RIDA® C18 2 мл метанола со скоростью 1 капля в секунду.
При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления воздуха на входе
в колонку используйте разовый пластиковый шприц на 5 мл.

12.1.3.2. Пропустите через колонку 2 мл буферного раствора трис/метанол (20%), рН 8.5 со
скоростью 1 капля в секунду.

12.1.3.3. Пропустите через колонку весь объем подготовленного раствора исследуемой
пробы со скоростью 1 капля в секунду.

12.1.3.4. Промойте колонку 2 мл буферного раствора трис/метанол (20%), рН 8.5 со
скоростью 1 капля в секунду.

12.1.3.5. Промойте колонку 3 мл 40% раствора метанола со скоростью 1 капля в секунду.
Удалите из колонки остатки жидкости.

12.1.3.6. Адсорбированные на колонке вещества осторожно, со скоростью 15 капель в
минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в чистую пробирку, объемом 5 мл.

12.1.3.7. В пробирку с элюатом добавляют 1 мл дистиллированной воды. Содержимое
пробирки перемешивают.

12.1.3.8. Для анализа используют 20 мкл раствора.
Элюаты в герметично закрытых пробирках могут храниться течении 3- 4 месяцев при
температуре - 20°С или 2 недели при температуре 2 - 8 °С.

12.2. Пробы мяса.
12.2.1. Исследуемые образцы мяса должны быть свободны от жира и соединительной
ткани.

12.2.2. Пробу мяса измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.

12.2.3. Навеску 10 г фарша и 10 мл 0.067 М фосфатного буферного раствора (рН 7.2)
переносят в коническую колбу на 50 мл, закрывают колбу притертой пробкой и энергично
встряхивают в течение 5-ти минут.

12.2.4. Навеску 2 г гомогената переносят в центрифужную пробирку на 10 - 15 мл,
снабженную завинчивающейся крышкой.

12.2.5. В центрифужную пробирку с гомогенатом вносят 5 мл метилтретбутилового
(диэтилового) эфира и энергично встряхивают содержимое в течении 20 мин при помощи
устройства для встряхивания проб либо вручную.

12.2.6. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 3000 д и
температуре 10 - 15°С в течение 10 мин.

12.2.7. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае недостаточно эффективного
разделения процедуру центрифугирования повторяют.

12.2.8. С помощью пипетки Пастера и груши эфирный слой переносят в пробирку
устройства для испарения экстрактов либо, при отсутствии такого устройства, в грушевидную 
колбу лабораторного микроиспарителя (см. Приложение 1). При заборе эфирного слоя в пипетку 
Пастера избегайте попадания в пипетку водной фазы.

12.2.9. Повторите процедуру экстракции согласно пп.12.2.5.-12.2.8.

12.2.10. Объедините эфирные экстракты и испарите их досуха в вытяжном шкафу.
Примечание: для испарения экстрактов можно использовать специализированное
устройство для испарения экстрактов, лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1), либо
водяную баню и подходящий к имеющейся центрифуге стеклянный флакон на 20 - 30 мл с
завинчивающейся крышкой, материал которой устойчив к использующимся реагентам. При
выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения контролируют с помощью
термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира - 55.5 °С, температура кипения
диэтилового эфира - 34.5°С).

12.2.11. После испарения эфирного слоя досуха в пробирку (флакон, колбу) с сухим
остатком поместите 1 мл 80% раствора метанола и тщательно омойте стенки пробирки (флакона,
колбы).

12.2.12. Смешайте метанольный раствор и 2 мл 0.02 М фосфатного буферного раствора.
Далее раствор очищается методом твердофазной экстракции.

12.2.13. Очистка методом твердофазной экстракции.

12.2.13.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции, руководствуясь
инструкцией по его эксплуатации, промойте колонку RIDA® C18 3 мл метанола со скоростью 1 
капля в секунду. При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления
воздуха на входе в колонку используйте разовый пластиковый шприц на 5 мл.

12.2.13.2. Пропустите через колонку 2 мл 0.02 М фосфатного буферного раствора со
скоростью 1 капля в секунду.

12.2.13.3. Пропустите через колонку весь объем подготовленного раствора исследуемой
пробы со скоростью 1 капля в секунду.

12.2.13.4. Промойте колонку 2 мл 40% раствора метанола со скоростью 1 капля в секунду.

12.2.13.5. Удалите из колонки остатки жидкости и высушите колонку, продувая ее воздухом
или азотом в течение 3-х минут.

12.2.13.6. Адсорбированные на колонке вещества осторожно, со скоростью 15 капель в
минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в чистую пробирку, объемом 5 мл.

12.2.13.7. В пробирку с элюатом добавляют 1 мл дистиллированной воды. Содержимое
пробирки перемешивают.

12.2.13.8. Для анализа используют 20 мкл раствора.
Элюаты в герметично закрытых пробирках могут храниться течении 3-4 месяцев при
температуре - 20°С или 2 недели при температуре 2 - 8 °С.

Примечание: процедура пробоподготовки, описанная в разделе 12.2 методики может
быть также использована и при определении тренболона,
метилтестостерона, этинилэстрадиола, тестостерона и эстрадиола-17бетта
в пробах мяса с помощью тест-систем RIDASCREEN® Trenbolon,
RIDASCREEN®   Methyltestosteron,   RIDASCREEN®   Ethinylostradiol,
RIDASCREEN® Testosteron и RIDASCREEN® 17p-Ostradiol

13. Порядок проведения измерений
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений с помощью тест-системы
RIDASCREEN® 19-Nortestosteron.

Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов до
комнатной (30 - 40 минут до температуры 18-20 °С)

Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2-8 гр.С

В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета

Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа существенно зависит от
тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной
далее процедуре отмывки планшета

На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.

13.2. Подготовка к измерениям
13.2.1. Приготовление препарата коньюгата
Коньюгат 19-нортестостерона с ферментом (флакон с красной крышкой) поставляется в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат коньюгата имеет ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата коньюгата осторожно встряхните содержимое
флакона. Для приготовления готового к использованию препарата коньюгата разбавьте
концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношении
1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата коньюгата с
2 мл буфера - данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)

13.2.2. Приготовление препарата антител
Антитела к 19-нортестостерону (флакон с черной крышкой) поставляются в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат антител имеет ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата антител осторожно встряхните содержимое
флакона. Для приготовления готового к использованию препарата антител разбавьте
концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношении
1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата антител с 2
мл буфера - данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)

13.2.3. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество
стрипов.

Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем
(осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8 °С.

13.2.4. Стандартные растворы
Стандартные растворы 19-нортестостерона поставляются готовыми для использования в
следующих концентрациях:
Стандарт 1                                             0 ppt
Стандарт 2                                           200 ppt
Стандарт 3                                           600 ppt
Стандарт 4                                          1800 ppt
Стандарт 5                                          5400 ppt
Стандарт  6                                                                                     16200 ppt

Примечание: 1 ppt = 1 нг/кг

13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех
запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите координаты лунок, 
предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример 
формы записи приведен на Рис.1.

Рисунок 1.      Пример формы записи координат лунок перед выполнением
                      анализа (С-стандарты, П-пробы).

13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл разбавленного препарата коньюгата в
каждую лунку и по 20 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары лунок.
При дозировании раствора коньюгата и выполнении последующих операций предпочтительно
использование 8-ми канального дозатора (при этом раствор удобно отбирать из специальной
ванночки или из чашки Петри).

13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл готового разбавленного препарата антител.
Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и оставьте
планшет на инкубацию в темноте в течение 2-х часов при комнатной температуре.

13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по
столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните каждую лунку 250 мкл дистиллированной
воды и вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано выше. Повторите процедуру промывки
лунок водой еще два раза.

13.3.5. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую лунку. Тщательно
перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.

13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо перемешайте. В
течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой
лунке при 450 нм.

14. Обработка результатов исследования
14.1. Вычисление концентрации 19-нортестостерона в исследуемых образцах.
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и
исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в
лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат
измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с
нулевым стандартом, то есть:

Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
-------------------------------------------------------------------   X 100 = % поглощения
Средняя оптическая плотность лунки
с нулевым стандартом

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и
соответствующим значениям концентрации 19-нортестостерона в нг/кг (ppt) строится
калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна
быть почти линейна в диапазоне 200 - 5400 нг/кг (см. Рис. 2).

Концентрация 19-нортестостерона в исследуемых растворах в нг/кг (ppt) считывается по
калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному
для этих растворов.

Для компьютерной обработки результатов измерении рекомендуется использовать
специализированное программное обеспечение, например, RIDA®Soft . При компьютерной
обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного
обеспечения.

Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию 19-нортестостерона в
исследуемой исходной пробе, величину концентрации 19-нортестостерона. полученную по
калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления. При
выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой
фактор разбавления принимает следующие значения:
Моча                    4
Мясо                    2
 

Концентрация, нг/кг
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы RIDASCREEN® 19-Nortestosteron

ПРИМЕЧАНИЕ: При положительном результате определения исследование образцов,
показавших положительный результат, повторяют. При повторном исследовании
образцов рекомендуется выполнить оценку коэффициента извлечения с
помощью внесения в образец добавки 19-нортестостерона на стадии
пробоподготовки в количестве, близком к найденному (см. Приложение 2).

15. Интерпретация результатов исследования
Использование 19-нортестостерона в животноводстве и птицеводстве,   импорт и
реализация продукции животного происхождения, содержащей остаточные количества 19-
нортестостерона, запрещены как в странах Евросоюза так и в Российской Федерации.

Чувствительность  иммуно-ферментного  метода  анализа  позволяет  определять
концентрации 19-нортестостерона в мясе на уровне 0.4 мкг/кг и более.

Однако, поскольку в практике ветеринарно-санитарного контроля при положительном
результате определения проводят подтверждающий анализ независимым методом (используется,
например,  хроматомасс-спектрометрия,  высокоэффективная жидкостная хроматография),
обладающим худшей чувствительностью,  результат определения  интерпретируют как
положительный если величина найденной концентрации больше предела обнаружения
независимого метода анализа.

Предел обнаружения хромато-масс-спектрометрического метода определения 19-
нортестосте-рона составляет 2 мкг/кг.

Пробы с найденной концентрацией 19-нортестостерона в диапазоне от 0.4 мкг/кг до 2 мкг/кг
рассматривают как «подозрительные».

*Поставляется 000 «СТАЙЛАБ» тел./факс (095) 265-44-05