МИНИСТЕРСТВО                                            УТВЕРЖДАЮ
  СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА                   Зам.Руководителя Департамента
   И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                          ветеринарии Минсельхозпрода 
 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                 России
(Минсельхозпрод России)                                                       В.В.Селиверстов

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ 

№ 13-7-2/1869 от  10.02.2000

           МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ
        ТРЕНБОЛОНА В ОБРАЗЦАХ МЯСА, ПЕЧЕНИ И ФЕКАЛИЙ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-
           СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ТРЕНБОЛОН (RIDASCREEN® TRENBOLON)
           (производство фирмы Ар-Биофарм/R-Biopharm, Германия)

1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения тренболона в мясе, печени и
фекалиях с помощью тест-системы для иммунно-ферментного анализа RIDASCREEN® Trenbolon".

2. Краткое описание методики
Пробоподготовка:                  Ферментативный гидролиз (только для образцов печени)
                                  Очистка методом твердофазной экстракции

Затраты времени:                  Пробоподготовка
                                  (при обработке 10-ти проб)          около 4 часов
                                  Анализ 
                                  (независимо от количества проб)     3 часа

Предел ружения
для образцов мяса:                                           0.0125 мкг/кг (12.5 ppt)
для образцов печени:                                            0.05 мкг/кг (50 ppt)
для образцов фекалий:                                       0.025 мкг/кг (25 ppt)

Сходимость результата анализа:                                  коэффициент вариации
                                                                                               не хуже 10%

Извлекаемость (для образцов мочи):                                          85%

Перекрестная чувствительность:
17(3-тренболон                                                                             100.0%
Трендион                                                                                        100.0%
17а-тренболон                                                                                82.0%
17р-тренболон-глюкоронид                                                       82.0%
17(х-тренболон-глюкоронид                                                       7.0%
19-нортестостерон                           <0.06%
тестостерон                                       < 0.01 %
эстрадиол                                          < 0.01 %
зеранол                                               < 0.01 %
диэтилстильбестрол                       < 0.01 %
левомицетин                                     < 0.01 %

3.Общие положения.
Тренболон является высокоэффективным синтетическим анаболическим стероидом,
обладающим также сильной андрогенной активностью.

Было, однако, показано, что тренболон вызывает трансформацию клеток, и может
причинить риск здоровью человека.

Использование тренболона в животноводстве и птицеводстве приводит к его накоплению в
продуктах животного происхождения и запрещено как в Российской Федерации так и в странах
Европейского союза (Указание Главного государственного ветеринарного инспектора от 4.10.99 №
12-7-1/900, Правила по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием
гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения,
утвержденные приказом МИНСЕЛЬХОЗПРОДА России от 18.08.99 № 604, Директивы Евросоюза
90/425/ЕЕС, 96/22/ЕС, 96/23/ЕС и др).

Для определения тренболона используются инструментальные физико-химические
методы анализа, такие как жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и хроиато-
масс-спектрометрия  (ГХ-МС).  Эти  методы,  однако,  предусматривают  использование
дорогостоящего оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании.

В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется более
удобный иммунно-ферментный метод анализа (ИФА, ELISA), являющийся официальным методом
контроля продуктов животного происхождения, принятым в странах Евросоюза (Директива
93/257/ЕЕС).

Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила
безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность.
Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура
средств защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы,
пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения
свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы
определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие
технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные
параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие
требования.

5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами.
Планшет, входящий в состав набора RIDASCREEN® Trenbolon, сенсибилизирован
овечьими антителами, специфичными к кроличьему иммуноглобулину IgG, который, в свою
очередь, получен путем иммунизации кроликов тренболоном. Анализ выполняется следующим
образом.

Исследуемые (стандартные) образцы, раствор, содержащий антитела к тренболону
(кроличий IgG) и раствор, содержащий коньюгат тренболона с ферментом, дозируются в лунки
планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы тренболона,
содержащегося в пробе или в стандартном растворе и молекулы коньюгата тренболона с
ферментом, конкурируя между собой, связываются антителами к тренболону в объеме раствора.
Одновременно происходит иммуносорбция антител к тренболону овечьими антителами на
поверхности планшета.

На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы
коньюгата тренболона с ферментом.

После промывки планшета в его лунки дозируется раствор субстрата (пероксид
карбамида) и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе инкубации, при химическом
взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата,
связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные
продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой
бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом
голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере) при 450 нм,
обратно пропорциональна концентрации тренболона в исследуемых образцах.


6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1. Предел обнаружения тренболона составляет:
-  0.0125 мкг/кг в мясе при навеске образца 10 г
-  0.05 мкг/кг в печени при навеске образца 1 г
-  0.025 УКГ/КГ в фекалиях при навеске образца 2 г

6.2. Диапазон определяемых концентрация тренболона составляет:
-  0.0125 - 0.2 мкг/кг в мясе при навеске образца 10 г
-  0.25 - 4.0 мкг/кг в мясе при навеске образца 10 г и разбавлении элюата в 20 раз
-  0.05 - 0.8 мкг/кг в печени при навеске образца 1 г
-  0.25 - 4.0 мкг/кг в печени при навеске образца 1 г и разбавлении элюата в 5 раз
-  0.025 - 0.4 икг/кг в фекалиях при навеске образца 2 г

7. Средства мзмерения, встомогтельные устройства, реактивы и материалы
7.1. Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Меры массы по ГОСТ 7328.
рН-метр.
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм.

Дозаторы на 8, 20, 50, 100, 250 и 1000 мкл.
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 50, 100 и 1000 мл исполнения 2 по ГОСТ 1770.
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50 и 100 мл по ГОСТ 1770.
Пипетки с одной отметкой 2-го класса точности вместимостью 1 мл по ГОСТ 29169.
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1, 5 и 10 мл по ГОСТ 29227.
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; цена деления 1°С, пределы измерения 0 -
100°С по ГОСТ 29224.

7.2. Вспомогательные устройства
Мясорубка по ГОСТ 4025
Микроизмельчитель тканей (гомогенизатор) РТ-2 или «Ультратюракс» с частотой 8000 -
24000 об/мин
Термостат с устанавливаемой температурой 37°С
Центрифуга с устанавливаемым ускорением 3000 g и охлаждением
Центрифужная пробирка емкостью 50 мл с завинчивающейся крышкой
Центрифужная пробирка на 5 мл
Баня водяная
Устройство для испарения экстрактов, например испарители ротационные типа ИР-1М-2,
В-580, системы TCS, «Эвапорэк» и др. или лабораторный микроиспаритель   (см.
Приложение 1.)
Устройство для перемешивания типа «вортекс»
Устройство для встряхивания проб
Устройство для твердофазной экстракции, например типа «Доркус», «Вакэлют» и д   или
разовый шприц пластиковый объемом 5 мл
Пипетки Пастера
Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Стаканы химические вместимостью 50,100, 250 и 1000 мл по ГОСТ 25336
Воронкм лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
Груша резиновая
Холодильник бытовой

7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа RIDASCREEN® Trenbolon в стандартной
комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок),
сенсибилизированный антителами к кроличьему IgG                    1 шт
Комплект стандартных растворов тренболона в 40%
водном растворе метанола со следующими
концентрациями (1 рр1=1нг/кг): 0 ppt (нулевой стандарт),
25 ppt, 50 ppt, 100 ppt, 200 ppt, 400 ppt, по 300 мкл           6 х 1 шт
Коньюгат тренболона с пероксидазой.конц. (красная крышка)           1 шт
Антитела к тренболону, конц. (черная крышка)                        1 шт
Субстрат, содержит пероксид карбамида,
7 мл (зеленая крышка)                                               1 шт
Хромоген, содержит тетраметилбензидин,
7 мл (голубая крышка)                                               1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты,
14 мл (желтая крышка)                                               1 шт
Буфер, для разбавленмя конц. растворов
коньюгата и антител, 25 мл                                          1 шт
Колонки для твердофазной экстракции марки RIDA® C18*
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Глюкоронидаза/арилсульфатаза из Helix promatia*
Метилтретбутмловый эфир, (СНз)зСОСНз
(возможна замена метилтретбутилового эфира диэтиловым эфиром)
Петролейный эфир, температура кипения 40 - 70°С
Метанол, СНзОН
Ортофосфорная кислота, НзРОз, концентрированная
Соляная кислота, HCI, концентрации 1М
Уксусная кислота, СНзСООН, концентрации 20% вес.
Ацетат натрия, тригидрат, СНзСООNа х ЗН2O
Гидрооксид натрия, NaOH
Трис-(гидроксиметил)-аминометан (трис), (СН2OH)3CNH2
Дигмдрофосфат натрия, дигидрат, NaH2PO4 x 2H2O
Гидрофосфат натрия, безводный, Na2HPO4
Хлорид натрия, NaCI
Железоаммонийные квасцы, 12-ти водные, NH4Fe(SO4)2 x 12H2O

Замечания по использованию и хранению тест-системы RIDASCREEN® Trenbolon
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности
определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с
другим номером партии.
Храните набор при температуре 2 - 8°С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет с
силикагелем и плотно закройте пакет.
Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны,
избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами.
Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора хромогена не
рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора хромогена
является признаком его порчи.
В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым
стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком порчи реагентов.

8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности
при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по
ГОСТ 12.1.018 и злектробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также
требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и
вспомогательные устройства.

8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено
приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с органическими растворителями необходимо проводить
в вытяжном шкафу с использованием резиновых перчаток.

9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего
высшее или среднее специальное образование, владеющего техникой иммунно-ферментного
анализа и освоившего метод в процессе стажировки.

10.Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
Температура воздуха                   20±10°С;
Атмосферное давление                  84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздуха                     не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети                     220 ± 10 В;
Частота переменного тока              50 ± 1 Гц

11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований 
11.1. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269 и ГОСТ 7702.0 и согласно действующей
нормативной документации.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.

11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию. При отсутствии
такой возможности допускается хранение образцов не более чем 2 суток с момента отбора при
температуре 2 - 8°С, либо 5-6 месяцев при температуре - 20°С.

11.3. Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1. Приготовление раствора фосфорной кислоты концентрации 1М.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 9.8г концентрированной ортофосфорной
кислоты. С помощью стеклянной воронки кислоту переносят в мерную колбу на 100 мл. Стакан
омывают двумя порциями дистиллированной воды по 10 мл. Смывы последовательно переносят
в мерную колбу с кислотой и разбавляют раствор дистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

11.3.3. Приготовление ацетатного буферного раствора концентрации 0.5М, рН 4.8
Навеску 6.8 г тригидрата ацетата натрия переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят
объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до
растворения ацетата натрия и переливают в химический стакан на 250 мл.

С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят рН до 4.8 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 20 % раствор уксусной
кислоты.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 недели.

11.3.4. Приготовление фосфатного буферного раствора, рН 7.2
Взвешивают 7.67 г безводного гидрофосфата натрия, 2.02 г дигидрата д и гидрофосфата
натрия и 8.7 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную колбу на 1000 мл и доводят объем
раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до растворения
осадка и переливают в химический стакан на 1000 мл.

С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят рН до 7.2 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя раствор ортофосфорной
кислоты.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

11.3.5. Приготовление буферного раствора трис/метанол (20%), рН 8.5
Навеску 0.242г. трис-(гидроксмметил)-аминометана переносят в мерную колбу на 100 мл и
доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают
до растворения осадка и с помощью рН-метра измеряют значение рН. При необходимости
доводят рН до 8.5 ± 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 1М
раствор соляной кислоты. Раствор с установленным значением рН переносят в колбу на 250 мл и
смешивают с 25 мл метанола.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

11.3.6. Приготовление 40% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 40 мл метанола и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

11.3.7. Приготовление 80% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 80 мл метанола и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

11.3.8. Приготовление раствора железоаммонийных квасцов.
Навеску 1.3 г железоаммонийных квасцов переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят
объем раствора до метки 1 М раствором ортофосфорной кислоты.

Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.

12. Пробоподготовка
12.1.Пробы мяса. 

12.1.1. Исследуемые образцы мяса должны быть свободны от жира и соединительной
ткани.

12.1.2. Пробу мяса измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.

12.1.3. Навеску 10 г фарша переносят в сосуд микроизмельчителя тканей и в течение
одной минуты гомогенизируют с 10 мл раствора фосфатного буфера, рН 7.2.

12.1.4. Навеску 8 г гомогената переносят в центрифужную пробирку снабженную
завинчивающейся крышкой.

12.1.5. В центрифужную пробирку с гомогенатом добавляют 8 мл метилтретбутилового
(или диэтилового) эфира и энергично встряхивают содержимое в течение 20 мин при помощи
устройства для встряхивания проб либо вручную.

12.1.6. Центрифужную пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении
3000 g в течение 10 мин

12.1.7. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае недостаточно эффективного
разделения процедуру центрифугирования повторяют.

12.1.8. С помощью пипетки Пастера и груши перенесите эфирный слой в пробирку
устройства для испарения экстрактов либо, при отсутствии такого устройства, в грушевидную
колбу лабораторного микроиспарителя (см. Приложение 1). При заборе эфирного слоя в пипетку
Пастера избегайте попадания в пипетку водной фазы.

12.1.9. Повторите процедуру экстракции согласно пп.12.1.5.-12.1.8.

12.1.10. Объедините эфирные экстракты и испарите их досуха в вытяжном шкафу
Примечание: для испарения экстрактов можно использовать специализированное
устройство для испарения экстрактов, лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1), либо
водяную баню и подходящий к имеющейся центрифуге стеклянный флакон на 30 мл с
завинчивающейся крышкой, материал которой устойчив к использующимся реагентам. При
выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения контролируют с помощью
термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира - 55.5 °С, температура кипения
диэтилового эфира - 34.5°С).

12.1.11. После испарения эфирного слоя досуха в сосуд с сухим остатком (в случае
использования лабораторной установки - в грушевидную колбу) поместите 1 мл 80% раствора
метанола и тщательно омойте стенки сосуда.

12.1.12. Для обезжиривания метанольного раствора поместите в сосуд 2 мл петролейного
эфира, закройте герметичной крышкой (притертой стеклянной пробкой) и энергично встряхивайте
сосуд в течении 15 секунд.

12.1.13. Перенесите содержимое сосуда в центрифужную пробирку на 5 мл,
центрифугируйте при 3000 g в течение 5 мин (если испарение эфирного экстракта проводилось в
стеклянном флаконе, центрифугирование выполняется непосредственно в этом флаконе).

12.1.14. С помощью пипетки Пастера отберите верхний слой петролейного эфира и
отбросьте его.

12.1.15. Поместите пробирку (флакон) с метанольным раствором на короткое время в
горячую водяную баню (40 - 50°) для испарения остатков петролейного эфира.

12.1.16. Внесите в пробирку (флакон) 3 мл дистиллированной воды и тщательно
перемешайте раствор.

Раствор может хранится 2-3 дня при температуре 2 - 8°С, либо 3-4 недели при
температуре - 20°С.

12.1.17. Очистка пробы методом твердофазной экстракции.

12.1.17.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции, руководствуясь
инструкцией по его эксплуатации, промойте колонку RIDA® C18 2 мл метанола со скоростью 1
капля в секунду. При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления
воздуха на входе в колонку используйте разовый пластиковый шприц на 5 мл.

12.1.17.2. Пропустите через колонку 2 мл буферного раствора трис/метанол (20%), рН 8.5
со скоростью 1 капля в секунду.

12.1.17.3. Пропустите через колонку весь объем подготовленного раствора исследуемой
пробы со скоростью 1 капля в секунду.

12.1.17.4. Промойте колонку 2 мл буферного раствора трис/метанол (20%), рН 8.5 со
скоростью 1 капля в секунду.

12.1.17.5. Промойте колонку 3 мл 40% раствора метанола со скоростью 1 капля в секунду.
После удаления из колонки остатков жидкости, колонка высушивается в токе воздуха или азота в
течение одной минуты.

12.1.17.6. Адсорбированные на сухой колонке вещества осторожно, со скоростью 15
капель в минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в чистую пробирку, объемом 5 мл.
Элюаты в герметично закрытых пробирках могут храниться в течении 3- 4 месяцев при
температуре - 20°С.

12.1.17.7. В пробирку с элюатом добавляют 1 мл дистиллированной воды. Содержимое
пробирки перемешивают.

12.1.17.8. Для анализа используют 20 мкл раствора.

12.2. Пробы фекалий.

12.2.1. Навеску 2 г пробы фекалий переносят в центрифужную пробирку и гомогенизируют
в течение одной минуты с 6 мл дистиллированной воды.

12.2.2. С помощью пипетки на 10 мл вносят в центрифужную пробирку 6 мл метилтрет-
бутилового (диэтилового) эфира, закрывают пробирку герметичной крышкой и встряхивают в
течение 20-тм мин вручную или с помощью устройства для встряхивания проб.

12.2.3. Центрифужную пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении
3000 g в течение 10 мин

12.2.4. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае недостаточно эффективного
разделения процедуру центрифугирования повторяют.

12.2.5. С помощью пипетки Пастера и груши перенесите эфирный слой в пробирку
устройства для испарения экстрактов либо, при отсутствии такого устройства, в грушевидную
колбу лабораторного микроиспарителя (см. Приложение 1). При заборе эфирного слоя в пипетку
Пастера избегайте попадания в пипетку водной фазы.

12.2.6. Испарите эфирный экстракт досуха в вытяжном шкафу, руководствуясь л.12.1.10.

12.2.7. После испарения эфирного слоя досуха в сосуд с сухим остатком (в случае
использования лабораторной установки - в грушевидную колбу) поместите 0.5 мл 80% раствора
метанола и тщательно омойте стенки сосуда.

12.2.8. Обезжирьте метанольный раствор, согласно пп. 12.1.12- 12.1.15.

12.2.9. Смешайте метанольный раствор в пробирке (флаконе) с 1 мл 1 М раствора
гидрооксида натрия, затем добавьте 0.7 мл раствора железоаммонийных квасцов, тщательно
перемешайте раствор и оставьте раствор на 10 мин.

12.2.10. Выпавший в объеме раствора осадок отделяется путем центрифугирования в
течение 10-ти минут при температуре 0°С и ускорении 3000 g.

12.2.11. После отделения осадка прозрачный раствор очищают методом твердофазной
экстракции согласно разделу 12.1.17.

12.3. Пробы печени.

12.3.1. Навеску 1 г пробы печени переносят в сосуд микроизмельчителя тканей и
гомогенизируют в течение одной минуты с 2 мл 0.5 М раствора ацетатного буфера, рН 4.8.

12.3.2. В смесь вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы и выдерживают раствор в
термостате при температуре 37°С в течении 3-х часов.

Гидролизат может хранится 2-3 дня при температуре 2 - 8°С, либо 3° 4 недели при
температуре - 20°С.

12.3.3. Далее следуют процедуре пробоподготовки, начиная с раздела 12.1.5.

13. Порядок проведения измерений.
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений с помощью тест-системы
RIDASCREEN® Trenbolon
-Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов до
комнатной
-Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до 
температуры  2-8°С
-В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета
-Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа существенно зависит
от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте
описанной далее процедуре отмывки планшета
-На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.

13.2. Подготовка к измерениям
13.2.1. Приготовление препарата коньюгата
Коныюгат тренболона с ферментом (флакон с красной крышкой) поставляется в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат коньюгата имеет ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата коньюгата осторожно встряхните
содержимое флакона. Для приготовления готового к использованию препарата коньюгата
разбавьте концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в
отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата
коньюгата с 2 мл буфера - данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32
определений)

13.2.2. Приготовление препарата антител
Антитела к тренболону (флакон с черной крышкой) поставляются в концентрированном
виде. Поскольку разбавленный препарат антител имеет ограниченную стабильность, перед
анализом следует готовить только необходимое количество препарата. Перед разбавлением
концентрированного препарата антител осторожно встряхните содержимое флакона. Для
приготовления готового к использованию препарата антител разбавьте концентрированный
препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, в
пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата антител с 2 мл буфера -
данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)

13.2.3. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество
стрипов.

Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с
смликагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 -
8°С.

13.2.4. Стандартные растворы
Стандартные растворы тренболона поставляются готовыми для использования в
следующих концентрациях:
Стандарт 1                                             0 ppt
Стандарт 2                                            25 ppt
Стандарт 3                                            50 ppt
Стандарт 4                                           100 ppt
Стандарт 5                                           200 ppt
Стандарт 6                                           400 ppt

Примечание: 1ppt = 1нг/кг

13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех
запланированных определений в дупликате (по 2 раза). Запишите координаты лунок,
предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример
формы записи приведен на Рис. 1.

Рисунок 1. Пример формы записи координат лунок перед выполнением анализа
(С-стандарты, П-пробы).

13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл разбавленного препарата коньюгата в
каждую лунку и по 20 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары лунок.
При дозировании раствора коньюгата предпочтительно использование 8-ми канального дозатора
(при этом раствор удобно отбирать из специальной ванночки или из чашки Петри).

13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл готового разбавленного препарата антител. При
выполнении этой и последующих операций предпочтительно использование 8-ми канального
дозатора. Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и
оставьте планшет на инкубацию в течение 2-х часов при комнатной температуре.

13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по
столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью дозатора наполните лунки 250 мкл
дистиллированной воды и снова вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано выше.
Повторите процедуру промывки лунок водой еще два раза.

13.3.5. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую лунку. Тщательно
перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.

13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо перемешайте. В
течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой
лунке при 450 нм.

14. Обработка результатов исследования.
14.1. Вычисление концентрации тренболона в исследуемых образцах.
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными
исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в
лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат
измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с
нулевым стандартом, то есть:

Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
----------------------------------Х 100 = % поглощения
Средняя оптическая плотность лунки
с нулевым стандартом

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и
соответствующим значениям концентрации тренболона в нг/кг (ppt) строится калибровочная
кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти
линейна в диапазоне 25 - 200 нг/кг (см. Рис. 2).

Концентрация тренболона в исследуемых растворах в нг/кг (ppt) считывается
калибровочной  кривой  соответственно  относительному  поглощению,  измеренному
вычисленному для этих растворов.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать
специализированное программное обеспечение, например, RIDA®Soft . При компьютерной
обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного
обеспечения.

Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию тренболона в исследуемой
исходной пробе, величину концентрации тренболона, полученную по калибровочной кривой,
следует умножить на соответствующий фактор разбавления. При выполнении
пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор
разбавления принимает следующие значения:
Мясо                                            0.5 (без разбавления элюата)
Мясо                                             10 (при разбавлении элюата в 20 раз по п. 12.1.17.8)
Печень                                            2 (без разбавления злюата)
Печень                                           10 (при разбавлении элюата в 5 раз по п. 12.1.17.8)
Фекалии                                           1
 

                          Концентрация, нг/кг
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы RIDASCREEN® Trenbolon

ПРИМЕЧАНИЕ:   При положительном результате определения исследование образцов,
показавших  положительный  результат,   повторяют.   При   повторном
исследовании образцов рекомендуется выполнить оценку коэффициента
извлечения с помощью внесения в образец добавки тренболона на стадии
пробоподготовки в количестве, близком к найденному (см. Приложение 2).

15. Интерпретация результатов исследования.
Использование тренболона в животноводстве и птицеводстве, импорт и реализация
продукции животного происхождения, содержащей остаточные количества тренболона, полностью
запрещены как в странах Евросоюза так и в Российской Федерации.

Чувствительность  иммуно-ферментного  метода  анализа  позволяет  определять
концентрации тренболона в мясе на уровне 0.0125 мкг/кг и более, а в печени 0.05 мкг/кг и более.
Однако, поскольку в практике ветеринарно-санитарного контроля при положительном
результате определения проводят подтверждающий анализ независимым    методом
(используется,   например,  хроматомасс-спектрометрия,   высокоэффективная  жидкостная
хроматография),   обладающим   худшей   чувствительностью,   результат   определения
интерпретируют как положительный если величина найденной концентрации больше предела
обнаружения независимого метода анализа.

Предел обнаружения хромато-масс-спектрометрического метода определения тренболона
составляет 2 мкг/кг.

Пробы с найденной концентрацией тренболона, не превышающей 2 мкг/кг, рассматривают
как «подозрительные».