МИНИСТЕРСТВО
УТВЕРЖДАЮ
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Зам. Руководителя Департамента
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ ветеринарии Минсельхозпрода
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ России
(Минсельхозпрод России)
В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
№ 13-7-2/1875 от 10.02.00
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ
ЗЕРАНОЛА В ОБРАЗЦАХ МЯСА, ПЕЧЕНИ И МОЧИ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-
СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ЗЕРАНОЛ (RIDASCREEN® ZERANOL)
(производство фирмы Ар-Биофарм/R-Biopharm, Германия)
1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения зеранола в мясе,
печени и
моче с помощью тест-системы для иммунно-ферментного анализа RIDASCREEN®
Zeranol'
2. Краткое описание методики
Пробоподготовка: Ферментативный гидролиз (только для образцов печени и
мочи)
Очистка методом переэкстракции (мясо, печень) и твердофазной
экстракции (моча)
Затраты времени:
Пробоподготовка (при обработке 10-ти проб мяса и печени)
около 4 часов
Пробоподготовка (при обработке 10-ти проб мочи) около
1 часа
Анализ (независимо от количества проб) 3 часа
Предел обнаружения для образцов мяса и печени: 0.016 мкг/кг (16 ppt)
для образцов мочи: 0.22 мкг/кг (220 ppt)
Сходимость результата анализа: коэффициент вариации не хуже 10%
Извлекаемость (для образцов мочи): 67%
Перекрестная чувcтвительность:
зеранол 100.0%
зеараланон 2.4 %
Р-зеараланол 4.0 %
зеараленон 0.3 %
ос-зеараленол 21.1 %
Р-зеараленол 2.5 %
эстрадиол-17р < 0.02 %
тестостерон < 0.02 %
кпенбутерол < 0.02 %
3. Общие положения
Зеранол является высокоэффективным синтетическим анаболическим
стероидом,
обладающим также эстрогенной активностью.
Использование зеранола в животноводстве и птицеводстве, импорт
и реализация
продуктов животного происхождения, содержащих остаточные концентрации
зеранола,
запрещены в Российской Федерации и в странах Европейского союза (Указание
Главного государственного ветеринарного инспектора от 4.10.99 № 12-7-1/900,
Правила по
организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных
стимуляторов
роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения, утвержденные
приказом
МИНСЕЛЬХОЗПРОДА России от 18.08.99 № 604, Директивы Евросоюза 89/662/ЕЕС,
90/425/ЕЕС,
96/22/ЕС, 96/23/ЕС и др).
Для определения зеранола используются инструментальные физико-химические
методы
анализа, такие как капиллярная газовая хроматография (ГХ) и хромато-масс-спектрометрия
(ГХ-
МС). Эти методы, однако, предусматривают использование дорогостоящего
оборудования,
нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании.
В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется
более удобный
иммунно-ферментный метод анализа (ИФА, ELISA), являющийся официальным
методом контроля
продуктов животного происхождения, принятым в странах Евросоюза (Директива
93/257/ЕЕС).
4. Нормативные ссылки
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила
безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность.
Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура
средств
защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки,
колбы,
пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы
определения
свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические
условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические
методы
определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые.
Общие
технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы,
основные
параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические
условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные.
Общие
требования.
5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами.
Планшет, входящий в состав набора RIDASCREEN® Zeranol, сенсибилизирован
овечьими
антителами, специфичными к кроличьему иммуноглобулину IgG, который, в свою
очередь, получен
путем иммунизации кроликов зеранолом. Анализ выполняется следующим образом.
Исследуемые (стандартные) образцы, раствор, содержащий антитела к
зеранолу (кроличий
IgG) и раствор, содержащий коньюгат зеранола с ферментом,
дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного
времени молекулы
зеранола, содержащегося в пробе или в стандартном растворе и молекулы коньюгата
зеранола с
ферментом, конкурируя между собой, связываются антителами к зеранолу в
объеме раствора.
Одновременно происходит иммуносорбция антител к зеранолу овечьими антителами
на
поверхности планшета.
На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные
молекулы
коньюгата зеранола с ферментом.
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор субстрата (пероксид
карбамида)
и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе инкубации, при химическом
взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы
коньюгата,
связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются
окрашенные
продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в
результате которой
бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент,
при этом
голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере)
при 450 нм,
обратно пропорциональна концентрации зеранола в исследуемых образцах.
6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1. Предел обнаружения зеранола составляет:
• 0.016 мкг/кг в мясе и печени при навеске образца 1 г
• 0.22 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
6.2. Диапазон определяемых концентрация зеранола составляет:
• 0.016 - 4.0 мкг/кг в мясе и печени при навеске образца 1 г
• 0.22 - 56.0 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
7.1. Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим
пределом
взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Меры массы по ГОСТ 7328
рН-метр
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Дозаторы на 8, 50, 100, 250 и 500 и 1000 мкл
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 100 мл исполнения 2
по ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50 и 100 мл по ГОСТ
1770
Пипетки с одной отметкой 2-го класса точности вместимостью 1 мл по
ГОСТ 29169
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1, 5 и 10
мл по ГОСТ 29227
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; цена деления 1°С, пределы измерения
0 - 100°С
по ГОСТ 29224.
7.2. Вспомогательные устройства
Мясорубка по ГОСТ 4025
Микроизмельчитель тканей (гомогенизатор) РТ-2 или “Ультратюракс” с
частотой 8000 -
24000 об/мин
Термомостат с устанавливаемой температурой 37°С
Центрифуга с устанавливаемым ускорением 3000 g и охлаждением
Центрифужная пробирка емкостью 20 мл с завинчивающейся крышкой
Центрифужная пробирка на 10 - 15 мл с завинчивающейся крышкой
Устройство для испарения экстрактов, например испарители ротационные
типа ИР-1М-2, В-
580, системы TCS, “Эвапорэк” и др. или лабораторный микроиспаритель
(см. Приложение 1)
Устройство для перемешивания типа “вортекс”
Устройство для встряхивания проб
Устройство для твердофазной экстракции, например типа “Доркус”, “Вакэлют”
и др. или
разовый шприц пластиковый объемом 5 мл
Пипетки Пастера
Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Стаканы химические вместимостью 50, 100, 250 и 1000 мл по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
Груша резиновая
Мембранный насос (возможно использование обычного аквариумного насоса)
Холодильник бытовой
7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа RIDASCREEN® Zeranol в
стандартной
комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок),
сенсибилизированный антителами к кроличьему IgG 1 шт
Комплект стандартных растворов зеранола в воде со
следующими концентрациями (1 рр1=1нг/кг): 0 ppt (нулевой
стандарт), 31.25 ppt, 125 ppt, 500 ppt, 2000 ppt,
8000 ppt, по 1 мл, 6 х 1 шт
Коньюгат зеранола с пероксидазой, конц. (красная крышка) 1 шт
Антитела к зеранолу, конц. (черная крышка) 1 шт
Субстрат, содержит пероксид карбамида, 7 мл (зеленая крышка) 1 шт
Хромоген, содержит тетраметилбензидин, 7 мл (голубая крышка) 1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты, 14 мл (желтая крышка)
1 шт
Буфер, для разбавления конц. растворов коньюгата и антител, 50 мл 1
шт
Колонки для твердофазной экстракции марки RIDA® С 18
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Глюкоронидаза/арилсульфатаза из Helix promatia
Диэтиловый эфир, (C2H5)2O
Хлороформ, СНСIз
Метанол, СНзОН
Уксусная кислота ледяная, СНзСООН
Ацетат натрия, тригидрат, CH3COONa x 3H2O
Гидрооксид натрия, NaOH
Замечания по использованию и хранению тест-системы RIDASCREEN® Zeranol
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности
определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого
набора с
другим номером партии.
Храните набор при температуре 2-8°С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный
пакет с
осушителем (силикагелем) и плотно закройте пакет.
Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны,
избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами.
Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора хромогена не
рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора
хромогена
является признаком его порчи.
В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с
нулевым
стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком порчи
реагентов.
8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники
безопасности
при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной
безопасности по
ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по
ГОСТ 12.1.019, а также
требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр
и вспомогательные
устройства.
8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно
быть снабжено
приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с органическими растворителями необходимо
проводить
в вытяжном шкафу с использованием резиновых перчаток.
9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста,
имеющего
высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в
химической
лаборатории, владеющего техникой иммунно-ферментного анализа и освоившего
метод в
процессе стажировки.
10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие
условия:
Температура воздуха 20+5 °С;
Атмосферное давление 84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети 220 ± 10 В;
Частота переменного тока 50 ± 1 Гц
11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269 и ГОСТ 7702.0 и согласно
действующей
нормативной документации.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.
11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию.
При отсутствии
такой возможности допускается хранение образцов не более чем 2 суток
с момента отбора при
температуре 2 - 8 °С, либо 5-6 месяцев при температуре - 20°С.
11.3. Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1. Приготовление 1М раствора гидрооксида натрия.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 4.0 г гидрооксида натрия.
В стакан наливают
50 мл дистиллированной воды и перемешивают раствор до полного растворения
щелочи. С
помощью стеклянной воронки раствор переносят в мерную колбу на 100 мл.
Стакан омывают двумя
порциями дистиллированной воды по 10 мл. Смывы последовательно переносят
в мерную колбу с
раствором и разбавляют раствор дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.
11.3.2. Приготовление 90% раствора уксусной кислоты.
В мерную колбу на 100 мл помещают 90 мл ледяной уксусной кислоты
и доводят объем
раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.
11.3.3. Приготовление 20% раствора уксусной кислоты.
В мерную колбу на 100 мл помещают 20 мл ледяной уксусной кислоты
и доводят объем
раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.
11.3.4. Приготовление ацетатного буферного раствора концентрации
0.05М, рН 4.8
Навеску 0.68 г тригидрата ацетата натрия переносят в мерную колбу
на 100 мл и доводят
объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают
до
растворения ацетата натрия и переливают в химический стакан на 250 мл.
С помощью рН-метра измеряют значение рН и при необходимости доводят
рН до 4.8 ± 0.1
осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 20 % раствор
уксусной кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня.
11.3.5. Приготовление 40% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 40 мл метанола и доводят объем
раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.
11.3.6. Приготовление 80% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 80 мл метанола и доводят объем
раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.
12. Пробоподготовка
12.1. Пробы мочи
12.1.1. Исследуемая проба мочи объемом 0.5 мл смешивается с 3 мл
ацетатного
буферного раствора концентрации 0.05 М (рН 4.8).
12.1.2. С помощью дозатора в смесь вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы
и
выдерживают раствор в термостате при температуре 37°С в течение 3-х часов.
12.1.3. Очистка пробы методом твердофазной экстракции.
12.1.3.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции, руководствуясь
инструкцией
по его эксплуатации, промойте колонку RIDA® C18 2 мл метанола со скоростью
1 капля в секунду.
При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления
воздуха на входе
в колонку используйте разовый пластиковый шприц на 5 мл.
12.1.3.2. Пропустите через колонку 2 мл ацетатного буферного раствора
концентрации 0.05
М (рН 4.8) со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.3. Пропустите через колонку 0.5 мл подготовленного раствора
исследуемой пробы со
скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.4. Промойте колонку 2 мл ацетатного буферного раствора концентрации
0.05 М (рН
4.8) со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.5. Промойте колонку 2 мл 40% раствора метанола со скоростью
1 капля в секунду.
Удалите из колонки остатки жидкости.
12.1.3.6. Адсорбированные на колонке вещества осторожно, со скоростью
15 капель в
минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в чистую пробирку, объемом
5 мл.
12.1.3.7. Пробирку с элюатом помещают в водяную баню,
находящуюся при температуре 50 - 60 °С. Температуру бани контролируют с
помощью термометра.
Раствор испаряют досуха в слабом токе воздуха, подающегося в пробирку мембранным
насосом
через пипетку Пастера, при этом кончик пипетки Пастера должен находиться
на расстоянии 2 - 3
см от поверхности метанольного раствора. Поток воздуха регулируют с помощью
зажима
Гофмана, стравливая избыточное давление через тройник в атмосферу.
12.1.3.8. Сухой остаток в пробирке растворяют в 0.5 мл буфера, входящего
в комплект
набора RIDASCREEN® Zeranol. Для анализа используют 50 мкл раствора.
Растворы в герметично закрытых пробирках могут храниться до 3-х дней
при температуре
2- 8°С.
12.2. Пробы мяса.
12.2.1. Исследуемые образцы мяса должны быть свободны от жира и соединительной
ткани.
12.2.2. Пробу мяса измельчают с помощью мясорубки мясорубки либо другим
способом.
12.2.3. Навеску 1 г фарша гомогенизируют с 2 мл дистиллированной воды
в центрифужной
пробирке на 20 мл в течение одной минуты (для этого удобно использовать
гомогенизатор
“Ультратюракс” с узким ножом)
12.2.4. При помощи пипетки в центрифужную пробирку с гомогенатом вносят
10 мл
диэтилового эфира, закрывают пробирку герметичной крышкой и энергично встряхивают
содержимое в течение 30 сек при помощи устройства типа “вортекс” либо вручную.
12.2.5. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении
3000 д в
течение 10 мин при температуре 15°С.
12.2.6. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае недостаточно
эффективного
разделения процедуру центрифугирования повторяют.
12.2.7. С помощью пипетки Пастера и груши перенесите эфирный слой
в пробирку
устройства для испарения экстрактов либо, при отсутствии такого устройства,
в грушевидную колбу
лабораторного микроиспарителя (см. Приложение 1). При заборе эфирного слоя
в пипетку Пастера
избегайте попадания в пипетку водной фазы.
Примечание: для облегчения отделения эфирного слоя водную фазу после
центрифугирования можно заморозить в криостате (60 минут при - 25°С или
30 минут при -60°С)
либо, при его отсутствии, в охлаждающей смеси сухой лед/ацетон.
12.2.8. Повторите процедуру экстракции с 5 мл диэтилового эфира согласно
пп.12.2.4.-
12.2.9. Объедините эфирные экстракты и испарите их досуха в
вытяжном шкафу.
Примечание: для испарения экстрактов можно использовать специализированное
устройство для испарения экстрактов, лабораторный микроиспаритель (см.
Приложение 1), либо
водяную баню и подходящий к имеющейся центрифуге стеклянный флакон на 30
мл с
завинчивающейся крышкой, материал которой устойчив к использующимся реагентам.
При
выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения контролируют
с помощью
термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира - 55.5°С, температура
кипения
диэтилового эфира - 34.5°С).
Сухой остаток в герметично закрытой емкости при температуре -20°С
может храниться до
одного месяца.
12.2.10. После испарения эфира сухой остаток растворите в 1 мл хлороформа,
тщательно
омывая стенки пробирки (флакона, колбы).
12.2.11. Смешайте хлороформный раствор с 3 мл 1 М раствора гидрооксида
натрия,
закройте пробирку (флакон, колбу) герметичной крышкой (притертой стеклянной
пробкой) и
энергично встряхивайте пробирку (флакон, колбу) в течение 30 секунд с помощью
встряхивателя
типа “вортекс” или вручную.
12.2.12. Перенесите содержимое сосуда в центрифужную пробирку на 10-15
мл,
центрифугируйте при 2000 д в течение 10 минут при температуре 15°С (если
испарение эфирного
экстракта проводилось в стеклянном флаконе, центрифугирование выполняется
непосредственно
в этом флаконе).
12.2.13. С помощью пипетки Пастера отберите верхний щелочной слой
и перенесите его в
другую центрифужную пробирку емкостью 10- 15 мл (при использовании стеклянного
флакона
осторожно отберите нижний хлороформный слой и отбросьте его).
Смешайте раствор с 250 мкл 90% уксусной кислоты.
12.2.14. В пробирку (флакон) с нейтрализованным водным раствором внесите
с помощью
пипетки 5 мл диэтилового эфира. В течение 30 секунд энергично встряхивайте
пробирку (флакон)
с помощью встряхивателя типа “вортекс” или вручную.
12.2.15. Поместите пробирку (флакон) в центрифугу и центрифугируйте
при 2000 д в
течение 10 минут при температуре 15°С.
12.2.16. Отделите эфирный экстракт и испарите его досуха в вытяжном
шкафу,
руководствуясь п.12.2.9 (при использовании стеклянного флакона испарение
проводится
непосредственно в этом же флаконе после отделения и отбрасывания нижнего
водного слоя).
Сухой остаток в герметично закрытой емкости при температуре -20°С
может храниться до
одного месяца.
12.2.17. Сухой остаток растворяют в 0.5 мл буфера, входящего в комплект
набора
RIDASCREEN® Zeranol. Для анализа используют 50 мкл раствора.
Герметично закрытые растворы могут храниться до 3-х дней при температуре
2- 8°С.
12.3. Пробы печени.
12.3.1. Пробу печени измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.
12.3.2. Навеску 1 г измельченной печени гомогенизируют с 2 мл дистиллированной
воды в
центрифужной пробирке на 20 мл в течение одной минуты (для этого удобно
использовать
гомогенизатор “Ультратюракс” с узким ножом).
12.3.3. В пробирку с гомогенатом вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы
и
выдерживают в термостате 2 часа при температуре 37°С.
12.3.4. Далее следуют процедуре пробоподготовки начиная с пункта 12.2.4.
Примечание; этот метод пробоподготовки можно также использовать при исследовании
почек.
При необходимости измерения высоких концентраций зеранола в образцах
печени,
почек и мяса (не менее 0.16 мкг/кг), раствор по п. 12.2.17 разбавляют
буфером
в 10 раз, при этом фактор разбавления также увеличивают в 10 раз (см.
раздел 14).
13. Порядок проведения измерений
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений с помощью
тест-системы
RIDASCREEN® Zeranol
^ Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов
до
комнатной (30 - 40 минут до температуры 18-20 °С)
^ Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до
температуры 2
-8°С
^ В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета
^ Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа существенно
зависит от
тщательности отмывки планшета в процессе анализа.
Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета
^ На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного
света.
13.2. Подготовка к измерениям
13.2.1. Приготовление препарата коньюгата
Коньюгат зеранола с ферментом (флакон с красной крышкой) поставляется
в
концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат коньюгата имеет
ограниченную
стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество
препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата коньюгата осторожно
встряхните
содержимое флакона.
Для приготовления готового к использованию препарата коньюгата разбавьте
концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте
набора,
в отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200
мкл
концентрированного препарата коньюгата с 2 мл буфера - данного разведения
достаточно
для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)
13.2.2. Приготовление препарата антител
Антитела к зеранолу (флакон с черной крышкой) поставляются в концентрированном
виде.
Поскольку разбавленный препарат антител имеет ограниченную стабильность,
перед анализом
следует готовить только необходимое количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата антител осторожно
встряхните
содержимое флакона. Для приготовления готового к использованию препарата
антител
разбавьте концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в
комплекте набора, в
отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного
препарата
антител с 2 мл буфера - данного разведения достаточно для 4-х стрипов,
то есть для 32
определений)
13.2.3. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое
количество
стрипов.
Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе
с
силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение
при температуре 2 -
8°С.
13.2.4. Стандартные растворы
Стандартные растворы зеранола поставляются готовыми для использования
в следующих
концентрациях:
Стандарт 1 0 ppt
Стандарт 2 31.25 ppt
Стандарт 3 125 ppt
Стандарт 4 500 ppt
Стандарт 5 2000 ppt
Стандарт 6 8000 ppt
Примечание: 1 ppt = 1 нг/кг
13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом
для выполнения всех
запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите координаты
лунок, предназначенных
для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов.
Пример формы записи приведен на Рис. 1.
С1 С1 ПЗ ПЗ П11 П11 П19 П19 П27 П27 П35 П35
С2 С2 П4 П4 П12 П12 П20 П20 П28 П28 П36 П36
СЗ СЗ П5 П5 П13 П13 П21 П21 П29 П29 П37 П37
С4 С4 П6 П6 П14 П14 П22 П22 ПЗО ПЗО ПЗЗ ПЗЗ
С5 С5 П7 П7 П15 П15 П23 П23 П31 П31 П39 П39
Сб С6 П8 П8 П16 П16 П24 П24 П32 П32 П49 П49
П1 П1 П9 П9 П17 П17 П25 П25 ПЗЗ ПЗЗ П41 П41
П2 П2 П10 П10 П18 П18 П26 П26 П34 П34 П42 П42
Рисунок 1. Пример формы записи координат лунок перед выполнением анализа
(С-стандарты, П-пробы).
13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл разбавленного препарата
коньюгата в
каждую лунку и по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие
пары лунок.
При дозировании раствора коньюгата и выполнении последующих операций предпочтительно
использование 8-ми канального дозатора (при этом раствор удобно отбирать
из специальной
ванночки или из чашки Петри).
13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл готового разбавленного препарата
антител.
Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в
лунках и оставьте
планшет на инкубацию в течение 2-х часов при комнатной температуре.
13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно
выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания
рамки с лунками по
столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки 250 мкл дистиллированной
воды и
вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано выше. Повторите процедуру
промывки лунок
водой еще два раза.
13.3.5. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую
лунку. Тщательно
перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут
в темноте.
13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо
перемешайте. В
течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую
плотность в каждой
лунке при 450 нм.
14. Обработка результатов исследований
14.1. Вычисление концентрации зеранола в исследуемых образцах.
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными
и
исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности,
измеренной в
лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100.
Таким образом, результат
измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической
плотности лунки с
нулевым стандартом, то есть:
Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
———————————————————————- X 100= % поглощения
Средняя оптическая
плотность лунки
с нулевым стандартом
По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных
растворов и
соответствующим значениям концентрации зеранола в нг/кг (ppt) строится
калибровочная кривая в
полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть
почти линейна в
диапазоне 31 - 2000 нг/кг (см. Рис. 2).
Концентрация зеранола в исследуемых растворах в нг/кг (ppt) считывается
по
калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному
и вычисленному
для этих растворов.
Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется специализированное
программное обеспечение, например, RIDA®Soft . При компьютерной обработке
результатов
следует руководствоваться инструкцией по использованию программного
обеспечения.
Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию зеранола в исследуемой
исходной
пробе, величину концентрации зеранола, полученную по калибровочной
кривой, следует
умножить на соответствующий фактор разбавления. При выполнении пробоподготовки
и
анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления
принимает
следующие значения:
Мясо и печень 0.5
Мясо и печень 5 (при разбавлении раствора по п. 12.2.17)
Моча 7
Концентрация, нг/кг
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы RIDASCREEN®
Zeranol
ПРИМЕЧАНИЕ: При положительном результате определения исследование образцов,
показавших положительный результат, повторяют. При повторном
исследовании образцов рекомендуется выполнить оценку коэффициента
извлечения с помощью внесения в образец добавки зеранола на
стадии
пробоподготовки в количестве, близком к найденному (см. Приложение
2).
15. Интерпретация результатов исследований
Использование зеранола в животноводстве и птицеводстве, импорт и реализация
продукции животного происхождения, содержащей остаточные количества зеранола,
полностью
запрещены как в странах Евросоюза так и в Российской Федерации.
Чувствительность иммуно-ферментного метода анализа позволяет определять
концентрации зеранола в мясе и печени на уровне 0.016 мкг/кг и более.
Однако, поскольку в практике ветеринарно-санитарного контроля при положительном
результате определения проводят подтверждающий анализ независимым методом
(используется,
например, хроматомасс-спектрометрия, капиллярная газовая хроматография),
обладающим
худшей чувствительностью, результат определения интерпретируют как положительный
если
величина найденной концентрации больше предела обнаружения независимого
метода анализа.
Предел обнаружения хромато-масс-спектрометрического метода определения
зеранола
составляет 2 мкг/кг.
Пробы с найденной концентрацией зеранола, не превышающей 2 мкг/кг,
рассматривают
как “подозрительные”.
.gif){kind=small}
.gif){kind=small}