НАСТАВЛЕНИЕ
                        ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
                         ОРНИТОЗА (ХЛАМИДИОЗА) ПТИЦ

1. Общие положения

2. Выявление комплементсвязывающих антител

3. Постановка ИФА

4. Обнаружение хламидий в патологическом материале

5. Выделение хламидий из патологического материала и их идентификация

6. Выявление и идентификация ДНК C.psittaci методом полимеразной 
цепной реакции (ПЦР)

7. Диагноз на орнитоз (пситтакоз) птиц считают предварительным

8. Сроки исследований








    МИНИСТЕРСТВО 
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА 
  И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ 
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России) 
      
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                         УТВЕРЖДАЮ
                                        Заместитель руководителя
26.04.99г.  № 13-7-2/1573               Департамента ветеринарии
                                             В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
по лабораторной диагностике 
орнитоза (хламидиоза) птиц.

1. Общие положения.

1.1. Лабораторные исследования на хламидиоз птиц включают:

- выявление специфических антител в сыворотке крови больных птиц 
в РСК (РНСК) или ИФА;

- обнаружение хламидий или антигенов хламидий в патологическом 
материале методом световой или люминесцентной микроскопии;

- выделение хламидий на куриных эмбрионах или лабораторных жи- 
вотных с последующей их идентификацией;

- выявление ДНК хламидий в патологическом материале методом 
полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.2. Работа с возбудителем хламидиоза птиц допускается в лабора- 
ториях, имеющих условия для работы с особо опасными инфекциями и раз- 
решение СЭС на работу с возбудителями 1-2 групп; исследования на хла- 
мидиоз проводят в отдельном боксе или отдельной комнате с настольным 
боксом.

Работа с возбудителем орнитоза также может проводиться в ПЦР-
лаборатории с предварительно инактивированным материалом, прогретым 
при 70-80 °С в течение 10 мин. или залитым 0,5%-ным раствором фенола или 
гуанидин тиоционатом в концентрации 5,3 моль/л.

1.3. Диагноз на хламидиоз птиц устанавливают на основании анализа 
эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических из- 
менений с учетом результатов лабораторных исследований.

В лабораторию для исследования направляют сыворотку крови, па- 
тологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет), павших
или вынужденно убитых птиц или патологический материал от них (кусочки 
печени, селезенки, экксудат брюшной полости).

Патологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет), 
для исследования необходимо брать в количестве не менее трех образцов 
от одной и той же особи в течение 5 суток в связи с непостоянным выделе- 
нием возбудителя у инфицированной птицы.

Сыворотку крови для серологического исследования берут на 5-12 
день заболевания и направляют в лабораторию в количестве 1-2 куб.см. Сы- 
воротки хранят при температуре минус (18-20) °С и исследуют одномомент-
но. Сыворотки гемолизированные или контаминированные бактериальной 
и грибковой флорой не пригодны.

Патологический материал берут только одноразовыми или 
стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с 
крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками, 
упаковывают в отдельные пакеты с номерами или надписями и доставляют 
в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал 
можно не более 7 суток при 4 °С и 10-12 мес. при температуре минус (18-
20) °С.

Патологический материал отбирают не позднее 2 ч. после гибели или 
убоя птицы с соблюдением правил асептики, помещают его в стерильные 
пробирки (флаконы) с резиновыми пробками и затем в термос со льдом.

Трупы птиц заворачивают в несколько слоев марли или ткани, смо- 
ченной 5%-ным раствором хлорамина, и помещают во влагонепроницае- 
мую тару, опечатывают и в тот же день (не позднее 24 часов после взятия) 
доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих рассеивание 
возбудителя. В лаборатории вскрытие трупов птиц с подозрением на хла-
мидиоз проводят в отдельном боксе с соблюдением правил работы с особо 
опасным материалом.

2. Выявление комплементсвязывающих антител.

2.1 Специфические антитела к хламидиям можно выявить в крови 
птиц, начиная с 5-12 дней после их заболевания, в реакции связывания 
комплемента (РСК), или реакции непрямого связывания комплемента 
(РНСК) или иммуноферментным анализом (ИФА). В отличие от РСК и ИФА, 
РНСК выявляет "неполные" антитела, образующиеся в крови некоторых 
видов птиц.

2.2. Постановка РСК.

2.2.1 Компоненты реакций и их подготовка к работе:

- комплементсвязывающий группоспецифический и контрольный ан- 
тигены, иммунную и отрицательные сыворотки, применяют в рабочих тит- 
рах, указанных на этикетках:

- стандартную гемолитическую сыворотку (гемолизин) используют в 
утроенном титре (например, титр гемолизина 1:1500, а в реакцию берут в 
разведении 1:500:

- эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем 
центрифугирования при 2500-3000 об/мин в течение 10-15 мин до полного 
просветления надосадочной жидкости и готовят 3%-ную взвесь из осадка 
на физиологическом растворе;

- комплемент (свежая, консервированная и лиофильно высушенная 
сыворотка морской свинки) в рабочем титре, установленном в день поста- 
новки реакции;

- физиологический раствор (0,85%) химически чистого хлорида на- 
трия в дистиллированной воде рН 7,2-7,4;

- испытуемые сыворотки (свежие или консервированные) разводят 
1:8 физраствором и инактивируют в водяной бане при 58-60 °С 30 мин.

Гемолитическую систему - смесь равных объемов 3% взвеси эритро- 
цитов и рабочего разведения гемолизина - выдерживают 30 мин. при 37 °С 
для сенсибилизации.

2.2.2. Титрование комплемента.

За рабочее разведение принимают разведение комплемента через 
одну влево от последней пробирки с полным гемолизом. В данном примере 
полный гемолиз получен при разведении комплемента 1:40, рабочее раз- 
ведение его 1:20

Определение рабочего разведения комплемента проводят по 
следующей схеме:
№№ пробирок
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Получаемые разведения комплемента 1:10 1:20 1:30 1:40 1:50 1:60 1:70 1:80 1:90 1:100
Комплемент в разведении 1:10
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Физиологический раствор
-
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
титрование комплемента
Комплемент в разведении
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Физиологический раствор
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
Гемолитическая система
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
водяная баня 37-38 гр.С-30мин.
Примерный результат
ПГ
ПГ
ПГ
ПГ
ЧГ
ЧГ
ЗГ
ЗГ
ЗГ
ЗГ
ПГ - полный гемолиз, ЧГ - частичный гемолиз, ЗГ - задержка гемолиза

Комплемент в рабочем разведении титруют на специфической, нега- 
тивной и испытуемой сыворотках в присутствии специфического антигена 
по следующей схеме:
Компоненты
№№ пробирок
/
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Комплемент в рабочем разведении 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1
Физиологический раствор
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
-
Антиген специфический в рабочем разведении
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Сыворотка негативная (специфическая, испытуемая), разведение 1:8
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Холодильник 4-6 гр.С - 16-18 часов
Гемолитическая система
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
Водяная баня 37-38 гр.С - 40 мин.
Титром комплемента считают минимальное его количество, вызы- 
вающее полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной и испытуе- 
мой сыворотками в присутствии антигена при задержке гемолиза в анало- 
гичной пробирке со специфической сывороткой.

Рабочей дозой является доза комплемента на один интервал вправо. 
В случае инкубации ингредиентов 16-18 ч. при 4-6 °С за рабочую дозу при- 
нимают удвоенный титр комплемента

Расчет количества чистого комплемента для главного опыта делают 
по формуле:

                 К х П 
                 -----
                   Р

где К - комплемент в рабочей дозе; П - количество пробирок в опыте;
      Р - рабочее разведение комплемента.

2.2.3. Постановка главного опыта РСК.

Реакцию ставят в объеме 0,5 куб.см в пробирках Флоринского. Разве- 
денные и инактивированные сыворотки исследуют со специфическим, кон- 
трольным антигенами и без антигена (контроль на антикомплементар-
ность).

Одновременно с главным опытом ставят контроли: позитивной сыво- 
ротки до ее предельного титра и негативной в том же разведении, как испы- 
туемые, со специфическим антигеном; специфического и контрольного ан- 
тигена - на антикомплементарность.

Главный опыт и контроли ставят по схеме:
Компоненты реакции
№№ пробирок
Контроли
.
1
2
3
сывороток
антигенов
Испытыемые сыворотки
0,1
0,1
0,1
-
-
-
-
-
-
-
-
Позитивная сыворотка до предельного титра
-
-
-
0,1
0,1
0,1
-
-
-
-
-
Негативная сыворотка 1:8
-
-
-
-
-
-
0,1
0,1
0,1
-
-
Антиген специфический в рабочем разведении
0,1
-
-
0,1
-
-
0,1
-
-
0,1
-
Антиген контрольный в рабочем разведении
-
0,1
-
-
0,1
-
-
0,1
-
-
0,1
Физиологический раствор
-
-
0,1
-
-
0,1
-
-
0,1
0,1
0,1
Комплемент в рабочем титре
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Водяная баня 37-38 гр.С - 1 час или холодильник 4-6 гр.С - 16-18 час.
Гемолитическая система
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
Водяная баня 37-38 гр.С - 40 мин.
2.2.4. Учет и оценка результатов реакции.

Реакцию учитывают через 30 мин. после извлечения штативов из во- 
дяной бани. Результаты реакции считают действительными при следующих 
показаниях контролей:

- задержка гемолиза в пробирках со специфическим антигеном и сы- 
вороткой до ее предельного титра;

- полный гемолиз во всех пробирках с негативной сывороткой, со спе- 
цифической сывороткой без антигена и с контрольным антигеном; в конт- 
ролях антигенов на антикомплементарность.

Оценку результатов реакции проводят по степени задержки гемолиза 
эритроцитов и выражают по четырехкрестовой системе:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость бес- 
цветная;
+++  (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов;
++   (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;
+    (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;
-    (минус) - полный гемолиз, осадок отсутствует.

Реакцию считают положительной при задержке гемолиза на 2-4 крес- 
та в пробирке с испытуемыми сыворотками в разведении 1:8 и специфи- 
ческим антигеном. Сомнительной при задержке гемолиза на 1 крест, отри- 
цательной - при полном гемолизе эритроцитов.

2.3 Постановка РНСК.

2.3.1. Постановку реакции до главного опыта проводят по той же 
схеме, что и РСК, но в объеме 0,6 куб.см (путем добавления 0,1 куб.см   
физиологического раствора).

2.3.2. Главный опыт РНСК проводят в три этапа:

1 этап - испытуемые сыворотки со специфическим и контрольным антиге- 
нами выдерживают 1 ч. при 37-38 °С.

2 этап - во все пробирки вносят иммунную сыворотку, разведенную до пре- 
дельного титра и комплемент в рабочей дозе по 0,1 куб.см, смесь инкубируют 
1 ч. при 37-38 °С или 16-18ч. при 4 °С.

3 этап - добавляют гемолитическую систему по 0,2 куб.см и выдерживают 
30 мин. при 37-38 °С.

2.3.3. Учет и оценка реакции.

Учет реакции проводят через 30 мин после изъятия штативов из во- 
дяной бани; степень гемолиза, как и в РСК, выражают по четырехкрестовой 
системе, но оценивают в обратном порядке:

      ++++ (4 креста) - реакция отрицательная;
      +++  (3 креста) - реакция отрицательная;
      ++   (2 креста) - реакция отрицательная;
      +    (1 крест) - реакция положительная;
      -    (минус) - реакция положительная.

3. Постановка ИФА.

3.1. ИФА применяют для ретроспективной диагностики орнитоза 
(пситтакоза) птиц и эпизоотологического обследования особей путем выяв- 
ления специфических антител в сыворотках крови.

3.2.Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии 
антител и антигена с последующим присоединением к полученному ком- 
плексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным 
вызвать разложение субстрата с образованием цветного продукта фермен- 
тативной реакции.

3.3. Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудо- 
вание:

3.3.1. В состав набора входят:

1 - специфический антиген хламидиозный,  лиофилизированный -
1 амп.;
2 - специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная -
1 амп.;
3 - отрицательная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;
4 - пероксидазный антивидовой конъюгат, лиофилизированный -
1 амп.

Химический набор, в состав которого входят:

 5-КН2Р04-1 амп.:
 6-К2НР04- 1 амп
 7-NaCI -1 амп :
 8-Твин-20 (-40.-80, Тритон Х-100)-1 амп.;
 9-лимонная кислота -1 амп.:
l0-K2HPO4-l амп ;
11-0-фенилендиамин - 2 амп.;
12-гидроперит -1 табл.;
13-две 96-луночные полистироловые планшеты с плоским дном для 
ИФА;
14-стоп-раствор -1 флакон. 
 
3.3.2. Оборудование:

1- одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом 
от 0,05 куб.см до 1 куб.см;
2 - стеклянные пипетки на 1 -2 куб.см;
3 - промывающее устройство;
4 - спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм. 

3.4. Приготовление рабочих растворов:

- Буфер №1 - (0,01М калий фосфатный, рН 7,2-7,4) предназначен для 
растворения антигена. Содержимое ампул 5,6,7 растворяют в 2500 куб.см дис- 
тиллированной воды, фильтруют, проверяют рН. При необходимости рН 
корректируют 0,1 N КОН или НСl.

- Буфер №2 - предназначен для растворения сывороток, конъюгата,
а также для промывки микропанелей. К 2000 куб.см буфера №1 добавляют со- 
держимое ампулы №8.

- Буфер №3 - (фосфатно-цитратный) предназначен для приготовле- 
ния субстрата (рН 5,0-5,2). Состоит из двух компонентов: растворов А и Б.

А - содержимое ампулы №9 растворить в 50 куб.см дистиллированной 
воды в мерной колбе.

Б - содержимое ампулы №10 растворить в 50 куб.см дистиллированной 
воды в мерной колбе, затем к 24,3 куб.см раствора А добавить 25,7 куб.см 
раствора Б и 50 куб.см дистиллированной воды, проверить рН. В случае необхо- 
димости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) 
компоненты буфера до установления требуемого рН. Изменение цвета 
субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является 
следствием использования для его приготовления недостаточно чистой по- 
суды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно 
перед использованием, хранению не подлежит.

Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непо- 
средственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления 
реакции на последней стадии Содержимое ампулы №11 растворить в 2 куб.см 
спирта-ректификата и добавить 48 куб.см буфера №3, внести 0,8 куб.см 
перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки №12 в 10 куб.см 
дистиллированной воды.

Буферные растворы хранят при температуре 4-6 гр.С не более 3 мес.

3.4.2. Подготовка биологических компонентов реакции:

Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 
20 куб.см буфера №1.

Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 куб.см 
буфера №2.

Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 куб.см бу- 
фера №2, получая разведение 1:200.

Растворенный антиген, сыворотки, антивидовой конъюгат хранят при 
4-6 °С в течение 3-4 дней.

3.5. Постановка иммуноферментной реакции.

Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.

3 5.1. Сорбция антигена на микропанели.

3.5.2. Промывание микропанели.

Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Ка- 
ждую лунку заполняют буфером №2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхи- 
вают. Промывание повторяют 4-5 раз.

Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое про- 
мывающее устройство.

3.5.3. Разведение сывороток.

В три лунки микропанели вертикального ряда А1, В1, С1 вносят по 
0,1 куб.см специфической положительной сыворотки (положительный кон- 
троль), а в три следующие лунки D1, Е1, F1 вносят по 0,1 куб.см 
отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены со- 
гласно п. 3.4.2. В лунки G1, Н1, которые служат контролем субстрата, вно- 
сят по 0,1 куб.см буфера №2. В горизонтальные ряды А, Е вносят, начиная с 
лунок А2 и Е2 по 0,2 см3 исследуемых парных проб сыворотки, подготов- 
ленных как указано в п. 3.4.3 и проводят раститровку по вертикальным ря- 
дам. начиная с разведения 1:200 до 1 :6000.

Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37 °С в термо- 
стате в течение часа.

3 5.4. Внесение конъюгата.

Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.

Во все лунки вносят по 0,1 куб.см рабочего раствора иммуноферментно-
го конъюгата, подготовленного согласно п. 3.4.2, и инкубируют в термостате 
при 37 °С в течение 1 часа.

3.5.5. Промывают 5 раз как указано в п.3.5.2.

3-5.6. Проявление реакции.

Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4 1.

Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 куб.см субстратно-
индикаторного раствора и выдерживают в темноте при комнатной темпера- 
туре 30-40 мин.

В каждую лунку вносят по 100 мкл стоп-раствора.

3.6 Учет результатов реакции.

Результаты учитывают в течение 30-40 мин. после внесения стоп-
раствора.

3.6.1 Визуальный учет: при наличии специфических антител наблю- 
дается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле

Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или 
имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

3.6.2.Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реак- 
ции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при 
длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотно- 
сти (ОП 490)

Положительными считаются пробы, ОП 490 которых в два и более раза 
превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но 
при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.

Сомнительные пробы - ОП 490 которых выше отрицательного контроля 
и составляют 0,150-0,199 оптических единиц.

Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свиде- 
тельствует об отрицательной реакции.

3.7. Интерпретация результатов ИФА.

Основанием для постановки предварительного диагноза на хлами-
диоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-
4 раза.

Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному 
исследованию и при подтверждении первоначального результата считают- 
ся положительными.

3.8. Птиц, с сыворотками крови которых получены положительные и 
сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диаг- 
ностики для постановки окончательного диагноза.

4. Обнаружение хламидий в патологическом материале.

Из патологического материала готовят мазки или мазки-отпечатки (с 
висцеральной поверхности внутренних органов: сердца, печени, селезенки;

при гидроперикардите - из перикардной жидкости) для световой и 
люминесцентной микроскопии.

4.1. Метод световой микроскопии. При исследовании материала 
методом световой микроскопии мазки или мазки-отпечатки окрашивают по 
Романовскому-Гимзе.

При окраске по Романовскому-Гимзе подсушенные на воздухе пре- 
параты фиксируют метиловым спиртом в течение 1 мин. или спирт-эфиром 
в течение 15-20 мин. и окрашивают краской Романовского-Гимзе, 
разведенной в соотношении 1:10 фосфатным буфером (рН 7,2-7,6) в 
течение 1,5 часов, после чего их промывают дистиллированной водой и 
высушивают фильтровальной бумагой.

Окрашенные и высушенные препараты просматривают в световом 
микроскопе под иммерсионным объективом. Цитоплазматические включе- 
ния представляют компактные или рыхло расположенные зернистые мас- 
сы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах 
его размножения. Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают 
его к периферии клетки, имеют разнообразную правильную или неправиль- 
ную форму, отличаясь по цвету и внутренней структуре от ядра и цито- 
плазмы. Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца со сред- 
ним диаметром от 0,5 до 1,2 мкм имеют сине-фиолетовый цвет, крупные 
включения, содержащие преимущественно мелкие зернистые структуры 
возбудителя имеют розово-красный цвет. Обычно в одной клетке выявля- 
ются включения хламидий разной степени зрелости и различной плотности 
расположения. Нередко, при рыхлом расположении морфологических 
структур микроорганизма, обнаруживается содержащая их вакуоль. 

4.2.Метод прямой и непрямой иммунофлюоресценции (ИФ).

Для исследования методом прямой и непрямой ИФ мазки готовят не- 
посредственно после взятия материала с конъюнктивы и клоаки у птиц, ис- 
пользуя одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной ад- 
сорбцией. Материал отбирают вращательным движением тампона и пере- 
носят на лунку предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют, 
указывая номер и дату взятия пробы. Приготовленный мазок высушивают 
на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в 96% этаноле в течение 5 мин. 
или наносят на мазок 2-3 капли ацетона до полного его испарения. Стекло с 
фиксированным препаратом может храниться при температуре (18-20) °С в 
течение 5 сут.

4.2.1. Для проведения прямой ИФ используют набор, в состав кото- 
рого входят:

- компонент №1 - лиофилизированные моноклональные антитела, 
меченные флюоресцеин-изотиацианатом (ФИТЦ) и содержащие краситель 
Эванса; сухая гомогенная аморфная масса синевато-сиреневого цвета - 1 
флакон, 0,1 куб.см;

- компонент №2 - растворитель для лиофилизированных иммуногло-
булинов, прозрачная бесцветная жидкость -1 флакон, 3,0 куб.см;

- компонент №3 - жидкость для "заключения" препарата, вязкая про- 
зрачная маслянистая жидкость -1 флакон, 2,0 куб.см. 

Оборудование:

      - люминесцентный микроскоп;
      - термостат на 37 °С;
      - чашки Петри;
      - предметные стекла с лункой;
      - фильтровальная бумага;
      - микропипетки на 30 мкл;
      - наконечники в штативе.

4.2.2. При исследовании прямым методом ИФ на специальную лунку 
предметного стекла с фиксированным материалом с помощью микропипет-
      ки вносят 30 мкл меченных ФИТЦ моноклинальных антител. С помощью 
наконечника пипетки или запаянной пастеровской пипетки равномерно рас- 
пределяют реагент по всей поверхности лунки с материалом.

4.2.3. Инкубация мазков-отпечатков. Мазки с нанесенным на них реа- 
гентом инкубируют во влажной камере (в чашке Петри) при температуре 
37±0.5 °С в течение 30 мин, периодически проверяя их состояние во избе- 
жание высыхания реагента на препарате, что может привести к ложнопо-
ложительным результатам при диагностике, поэтому высохшие препараты 
бракуются.

4.2.4 Промывание предметных стекол. По истечении срока инкубации 
предметные стекла тщательно промывают дистиллированной водой в те- 
чение 10с, остатки воды удаляют с краев стекла фильтровальной бума- 
гой и высушивают на воздухе.

4.2.5. Микроскопирование мазков. На мазок наносят 20 мкл жидкости 
для "заключения" препарата (компонент №3), покрывают обезжиренным 
покровным стеклом и просматривают препарат в люминесцентном микро- 
скопе при комбинации светофильтров СЗ 24-3, ФС 1-2, БС 8-3 при исполь- 
зовании окуляра Х 10 и объектива с масляной иммерсией Х 90, с использо- 
ванием нефлюоресцирующего иммерсионного масла. Препарат рекомен- 
дуется просматривать сразу же после приготовления. Смонтированные 
препараты можно хранить при температуре 2-8 °С не более 24 ч.