НАСТАВЛЕНИЕ
                        ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
                         ОРНИТОЗА (ХЛАМИДИОЗА) ПТИЦ

1. Общие положения

2. Выявление комплементсвязывающих антител

3. Постановка ИФА

4. Обнаружение хламидий в патологическом материале

5. Выделение хламидий из патологического материала и их идентификация

6. Выявление и идентификация ДНК C.psittaci методом полимеразной 
цепной реакции (ПЦР)

7. Диагноз на орнитоз (пситтакоз) птиц считают предварительным

8. Сроки исследований

    МИНИСТЕРСТВО 
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА 
  И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ 
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России) 
      
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                         УТВЕРЖДАЮ
                                        Заместитель руководителя
26.04.99г.  № 13-7-2/1573               Департамента ветеринарии
                                             В.В.Селиверстов
НАСТАВЛЕНИЕ
по лабораторной диагностике 
орнитоза (хламидиоза) птиц.

1. Общие положения.

1.1. Лабораторные исследования на хламидиоз птиц включают:

- выявление специфических антител в сыворотке крови больных птиц 
в РСК (РНСК) или ИФА;

- обнаружение хламидий или антигенов хламидий в патологическом 
материале методом световой или люминесцентной микроскопии;

- выделение хламидий на куриных эмбрионах или лабораторных жи- 
вотных с последующей их идентификацией;

- выявление ДНК хламидий в патологическом материале методом 
полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.2. Работа с возбудителем хламидиоза птиц допускается в лабора- 
ториях, имеющих условия для работы с особо опасными инфекциями и раз- 
решение СЭС на работу с возбудителями 1-2 групп; исследования на хла- 
мидиоз проводят в отдельном боксе или отдельной комнате с настольным 
боксом.

Работа с возбудителем орнитоза также может проводиться в ПЦР-
лаборатории с предварительно инактивированным материалом, прогретым 
при 70-80 °С в течение 10 мин. или залитым 0,5%-ным раствором фенола или 
гуанидин тиоционатом в концентрации 5,3 моль/л.

1.3. Диагноз на хламидиоз птиц устанавливают на основании анализа 
эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических из- 
менений с учетом результатов лабораторных исследований.

В лабораторию для исследования направляют сыворотку крови, па- 
тологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет), павших
или вынужденно убитых птиц или патологический материал от них (кусочки 
печени, селезенки, экксудат брюшной полости).

Патологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет), 
для исследования необходимо брать в количестве не менее трех образцов 
от одной и той же особи в течение 5 суток в связи с непостоянным выделе- 
нием возбудителя у инфицированной птицы.

Сыворотку крови для серологического исследования берут на 5-12 
день заболевания и направляют в лабораторию в количестве 1-2 куб.см. Сы- 
воротки хранят при температуре минус (18-20) °С и исследуют одномомент-
но. Сыворотки гемолизированные или контаминированные бактериальной 
и грибковой флорой не пригодны.

Патологический материал берут только одноразовыми или 
стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с 
крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками, 
упаковывают в отдельные пакеты с номерами или надписями и доставляют 
в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал 
можно не более 7 суток при 4 °С и 10-12 мес. при температуре минус (18-
20) °С.

Патологический материал отбирают не позднее 2 ч. после гибели или 
убоя птицы с соблюдением правил асептики, помещают его в стерильные 
пробирки (флаконы) с резиновыми пробками и затем в термос со льдом.

Трупы птиц заворачивают в несколько слоев марли или ткани, смо- 
ченной 5%-ным раствором хлорамина, и помещают во влагонепроницае- 
мую тару, опечатывают и в тот же день (не позднее 24 часов после взятия) 
доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих рассеивание 
возбудителя. В лаборатории вскрытие трупов птиц с подозрением на хла-
мидиоз проводят в отдельном боксе с соблюдением правил работы с особо 
опасным материалом.

2. Выявление комплементсвязывающих антител.

2.1 Специфические антитела к хламидиям можно выявить в крови 
птиц, начиная с 5-12 дней после их заболевания, в реакции связывания 
комплемента (РСК), или реакции непрямого связывания комплемента 
(РНСК) или иммуноферментным анализом (ИФА). В отличие от РСК и ИФА, 
РНСК выявляет "неполные" антитела, образующиеся в крови некоторых 
видов птиц.

2.2. Постановка РСК.

2.2.1 Компоненты реакций и их подготовка к работе:

- комплементсвязывающий группоспецифический и контрольный ан- 
тигены, иммунную и отрицательные сыворотки, применяют в рабочих тит- 
рах, указанных на этикетках:

- стандартную гемолитическую сыворотку (гемолизин) используют в 
утроенном титре (например, титр гемолизина 1:1500, а в реакцию берут в 
разведении 1:500:

- эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем 
центрифугирования при 2500-3000 об/мин в течение 10-15 мин до полного 
просветления надосадочной жидкости и готовят 3%-ную взвесь из осадка 
на физиологическом растворе;

- комплемент (свежая, консервированная и лиофильно высушенная 
сыворотка морской свинки) в рабочем титре, установленном в день поста- 
новки реакции;

- физиологический раствор (0,85%) химически чистого хлорида на- 
трия в дистиллированной воде рН 7,2-7,4;

- испытуемые сыворотки (свежие или консервированные) разводят 
1:8 физраствором и инактивируют в водяной бане при 58-60 °С 30 мин.

Гемолитическую систему - смесь равных объемов 3% взвеси эритро- 
цитов и рабочего разведения гемолизина - выдерживают 30 мин. при 37 °С 
для сенсибилизации.

2.2.2. Титрование комплемента.

За рабочее разведение принимают разведение комплемента через 
одну влево от последней пробирки с полным гемолизом. В данном примере 
полный гемолиз получен при разведении комплемента 1:40, рабочее раз- 
ведение его 1:20

Определение рабочего разведения комплемента проводят по 
следующей схеме:

ПГ - полный гемолиз, ЧГ - частичный гемолиз, ЗГ - задержка гемолиза

Комплемент в рабочем разведении титруют на специфической, нега- 
тивной и испытуемой сыворотках в присутствии специфического антигена 
по следующей схеме:

Титром комплемента считают минимальное его количество, вызы- 
вающее полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной и испытуе- 
мой сыворотками в присутствии антигена при задержке гемолиза в анало- 
гичной пробирке со специфической сывороткой.

Рабочей дозой является доза комплемента на один интервал вправо. 
В случае инкубации ингредиентов 16-18 ч. при 4-6 °С за рабочую дозу при- 
нимают удвоенный титр комплемента

Расчет количества чистого комплемента для главного опыта делают 
по формуле:

                 К х П 
                 -----
                   Р

где К - комплемент в рабочей дозе; П - количество пробирок в опыте;
      Р - рабочее разведение комплемента.

2.2.3. Постановка главного опыта РСК.

Реакцию ставят в объеме 0,5 куб.см в пробирках Флоринского. Разве- 
денные и инактивированные сыворотки исследуют со специфическим, кон- 
трольным антигенами и без антигена (контроль на антикомплементар-
ность).

Одновременно с главным опытом ставят контроли: позитивной сыво- 
ротки до ее предельного титра и негативной в том же разведении, как испы- 
туемые, со специфическим антигеном; специфического и контрольного ан- 
тигена - на антикомплементарность.

Главный опыт и контроли ставят по схеме:

2.2.4. Учет и оценка результатов реакции.

Реакцию учитывают через 30 мин. после извлечения штативов из во- 
дяной бани. Результаты реакции считают действительными при следующих 
показаниях контролей:

- задержка гемолиза в пробирках со специфическим антигеном и сы- 
вороткой до ее предельного титра;

- полный гемолиз во всех пробирках с негативной сывороткой, со спе- 
цифической сывороткой без антигена и с контрольным антигеном; в конт- 
ролях антигенов на антикомплементарность.

Оценку результатов реакции проводят по степени задержки гемолиза 
эритроцитов и выражают по четырехкрестовой системе:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость бес- 
цветная;
+++  (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов;
++   (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;
+    (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;
-    (минус) - полный гемолиз, осадок отсутствует.

Реакцию считают положительной при задержке гемолиза на 2-4 крес- 
та в пробирке с испытуемыми сыворотками в разведении 1:8 и специфи- 
ческим антигеном. Сомнительной при задержке гемолиза на 1 крест, отри- 
цательной - при полном гемолизе эритроцитов.

2.3 Постановка РНСК.

2.3.1. Постановку реакции до главного опыта проводят по той же 
схеме, что и РСК, но в объеме 0,6 куб.см (путем добавления 0,1 куб.см   
физиологического раствора).

2.3.2. Главный опыт РНСК проводят в три этапа:

1 этап - испытуемые сыворотки со специфическим и контрольным антиге- 
нами выдерживают 1 ч. при 37-38 °С.

2 этап - во все пробирки вносят иммунную сыворотку, разведенную до пре- 
дельного титра и комплемент в рабочей дозе по 0,1 куб.см, смесь инкубируют 
1 ч. при 37-38 °С или 16-18ч. при 4 °С.

3 этап - добавляют гемолитическую систему по 0,2 куб.см и выдерживают 
30 мин. при 37-38 °С.

2.3.3. Учет и оценка реакции.

Учет реакции проводят через 30 мин после изъятия штативов из во- 
дяной бани; степень гемолиза, как и в РСК, выражают по четырехкрестовой 
системе, но оценивают в обратном порядке:

      ++++ (4 креста) - реакция отрицательная;
      +++  (3 креста) - реакция отрицательная;
      ++   (2 креста) - реакция отрицательная;
      +    (1 крест) - реакция положительная;
      -    (минус) - реакция положительная.

3. Постановка ИФА.

3.1. ИФА применяют для ретроспективной диагностики орнитоза 
(пситтакоза) птиц и эпизоотологического обследования особей путем выяв- 
ления специфических антител в сыворотках крови.

3.2.Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии 
антител и антигена с последующим присоединением к полученному ком- 
плексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным 
вызвать разложение субстрата с образованием цветного продукта фермен- 
тативной реакции.

3.3. Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудо- 
вание:

3.3.1. В состав набора входят:

1 - специфический антиген хламидиозный,  лиофилизированный -
1 амп.;
2 - специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная -
1 амп.;
3 - отрицательная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;
4 - пероксидазный антивидовой конъюгат, лиофилизированный -
1 амп.

Химический набор, в состав которого входят:

 5-КН2Р04-1 амп.:
 6-К2НР04- 1 амп
 7-NaCI -1 амп :
 8-Твин-20 (-40.-80, Тритон Х-100)-1 амп.;
 9-лимонная кислота -1 амп.:
l0-K2HPO4-l амп ;
11-0-фенилендиамин - 2 амп.;
12-гидроперит -1 табл.;
13-две 96-луночные полистироловые планшеты с плоским дном для 
ИФА;
14-стоп-раствор -1 флакон. 
 
3.3.2. Оборудование:

1- одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом 
от 0,05 куб.см до 1 куб.см;
2 - стеклянные пипетки на 1 -2 куб.см;
3 - промывающее устройство;
4 - спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм. 

3.4. Приготовление рабочих растворов:

- Буфер №1 - (0,01М калий фосфатный, рН 7,2-7,4) предназначен для 
растворения антигена. Содержимое ампул 5,6,7 растворяют в 2500 куб.см дис- 
тиллированной воды, фильтруют, проверяют рН. При необходимости рН 
корректируют 0,1 N КОН или НСl.

- Буфер №2 - предназначен для растворения сывороток, конъюгата,
а также для промывки микропанелей. К 2000 куб.см буфера №1 добавляют со- 
держимое ампулы №8.

- Буфер №3 - (фосфатно-цитратный) предназначен для приготовле- 
ния субстрата (рН 5,0-5,2). Состоит из двух компонентов: растворов А и Б.

А - содержимое ампулы №9 растворить в 50 куб.см дистиллированной 
воды в мерной колбе.

Б - содержимое ампулы №10 растворить в 50 куб.см дистиллированной 
воды в мерной колбе, затем к 24,3 куб.см раствора А добавить 25,7 куб.см 
раствора Б и 50 куб.см дистиллированной воды, проверить рН. В случае необхо- 
димости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) 
компоненты буфера до установления требуемого рН. Изменение цвета 
субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является 
следствием использования для его приготовления недостаточно чистой по- 
суды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно 
перед использованием, хранению не подлежит.

Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непо- 
средственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления 
реакции на последней стадии Содержимое ампулы №11 растворить в 2 куб.см 
спирта-ректификата и добавить 48 куб.см буфера №3, внести 0,8 куб.см 
перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки №12 в 10 куб.см 
дистиллированной воды.

Буферные растворы хранят при температуре 4-6 гр.С не более 3 мес.

3.4.2. Подготовка биологических компонентов реакции:

Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 
20 куб.см буфера №1.

Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 куб.см 
буфера №2.

Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 куб.см бу- 
фера №2, получая разведение 1:200.

Растворенный антиген, сыворотки, антивидовой конъюгат хранят при 
4-6 °С в течение 3-4 дней.

3.5. Постановка иммуноферментной реакции.

Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.

3 5.1. Сорбция антигена на микропанели.

3.5.2. Промывание микропанели.

Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Ка- 
ждую лунку заполняют буфером №2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхи- 
вают. Промывание повторяют 4-5 раз.

Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое про- 
мывающее устройство.

3.5.3. Разведение сывороток.

В три лунки микропанели вертикального ряда А1, В1, С1 вносят по 
0,1 куб.см специфической положительной сыворотки (положительный кон- 
троль), а в три следующие лунки D1, Е1, F1 вносят по 0,1 куб.см 
отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены со- 
гласно п. 3.4.2. В лунки G1, Н1, которые служат контролем субстрата, вно- 
сят по 0,1 куб.см буфера №2. В горизонтальные ряды А, Е вносят, начиная с 
лунок А2 и Е2 по 0,2 см3 исследуемых парных проб сыворотки, подготов- 
ленных как указано в п. 3.4.3 и проводят раститровку по вертикальным ря- 
дам. начиная с разведения 1:200 до 1 :6000.

Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37 °С в термо- 
стате в течение часа.

3 5.4. Внесение конъюгата.

Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.

Во все лунки вносят по 0,1 куб.см рабочего раствора иммуноферментно-
го конъюгата, подготовленного согласно п. 3.4.2, и инкубируют в термостате 
при 37 °С в течение 1 часа.

3.5.5. Промывают 5 раз как указано в п.3.5.2.

3-5.6. Проявление реакции.

Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4 1.

Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 куб.см субстратно-
индикаторного раствора и выдерживают в темноте при комнатной темпера- 
туре 30-40 мин.

В каждую лунку вносят по 100 мкл стоп-раствора.

3.6 Учет результатов реакции.

Результаты учитывают в течение 30-40 мин. после внесения стоп-
раствора.

3.6.1 Визуальный учет: при наличии специфических антител наблю- 
дается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле

Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или 
имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.

3.6.2.Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реак- 
ции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при 
длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотно- 
сти (ОП 490)

Положительными считаются пробы, ОП 490 которых в два и более раза 
превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но 
при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.

Сомнительные пробы - ОП 490 которых выше отрицательного контроля 
и составляют 0,150-0,199 оптических единиц.

Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свиде- 
тельствует об отрицательной реакции.

3.7. Интерпретация результатов ИФА.

Основанием для постановки предварительного диагноза на хлами-
диоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-
4 раза.

Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному 
исследованию и при подтверждении первоначального результата считают- 
ся положительными.

3.8. Птиц, с сыворотками крови которых получены положительные и 
сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диаг- 
ностики для постановки окончательного диагноза.

4. Обнаружение хламидий в патологическом материале.

Из патологического материала готовят мазки или мазки-отпечатки (с 
висцеральной поверхности внутренних органов: сердца, печени, селезенки;

при гидроперикардите - из перикардной жидкости) для световой и 
люминесцентной микроскопии.

4.1. Метод световой микроскопии. При исследовании материала 
методом световой микроскопии мазки или мазки-отпечатки окрашивают по 
Романовскому-Гимзе.

При окраске по Романовскому-Гимзе подсушенные на воздухе пре- 
параты фиксируют метиловым спиртом в течение 1 мин. или спирт-эфиром 
в течение 15-20 мин. и окрашивают краской Романовского-Гимзе, 
разведенной в соотношении 1:10 фосфатным буфером (рН 7,2-7,6) в 
течение 1,5 часов, после чего их промывают дистиллированной водой и 
высушивают фильтровальной бумагой.

Окрашенные и высушенные препараты просматривают в световом 
микроскопе под иммерсионным объективом. Цитоплазматические включе- 
ния представляют компактные или рыхло расположенные зернистые мас- 
сы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах 
его размножения. Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают 
его к периферии клетки, имеют разнообразную правильную или неправиль- 
ную форму, отличаясь по цвету и внутренней структуре от ядра и цито- 
плазмы. Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца со сред- 
ним диаметром от 0,5 до 1,2 мкм имеют сине-фиолетовый цвет, крупные 
включения, содержащие преимущественно мелкие зернистые структуры 
возбудителя имеют розово-красный цвет. Обычно в одной клетке выявля- 
ются включения хламидий разной степени зрелости и различной плотности 
расположения. Нередко, при рыхлом расположении морфологических 
структур микроорганизма, обнаруживается содержащая их вакуоль. 

4.2.Метод прямой и непрямой иммунофлюоресценции (ИФ).

Для исследования методом прямой и непрямой ИФ мазки готовят не- 
посредственно после взятия материала с конъюнктивы и клоаки у птиц, ис- 
пользуя одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной ад- 
сорбцией. Материал отбирают вращательным движением тампона и пере- 
носят на лунку предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют, 
указывая номер и дату взятия пробы. Приготовленный мазок высушивают 
на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в 96% этаноле в течение 5 мин. 
или наносят на мазок 2-3 капли ацетона до полного его испарения. Стекло с 
фиксированным препаратом может храниться при температуре (18-20) °С в 
течение 5 сут.

4.2.1. Для проведения прямой ИФ используют набор, в состав кото- 
рого входят:

- компонент №1 - лиофилизированные моноклональные антитела, 
меченные флюоресцеин-изотиацианатом (ФИТЦ) и содержащие краситель 
Эванса; сухая гомогенная аморфная масса синевато-сиреневого цвета - 1 
флакон, 0,1 куб.см;

- компонент №2 - растворитель для лиофилизированных иммуногло-
булинов, прозрачная бесцветная жидкость -1 флакон, 3,0 куб.см;

- компонент №3 - жидкость для "заключения" препарата, вязкая про- 
зрачная маслянистая жидкость -1 флакон, 2,0 куб.см. 

Оборудование:

      - люминесцентный микроскоп;
      - термостат на 37 °С;
      - чашки Петри;
      - предметные стекла с лункой;
      - фильтровальная бумага;
      - микропипетки на 30 мкл;
      - наконечники в штативе.

4.2.2. При исследовании прямым методом ИФ на специальную лунку 
предметного стекла с фиксированным материалом с помощью микропипет-
      ки вносят 30 мкл меченных ФИТЦ моноклинальных антител. С помощью 
наконечника пипетки или запаянной пастеровской пипетки равномерно рас- 
пределяют реагент по всей поверхности лунки с материалом.

4.2.3. Инкубация мазков-отпечатков. Мазки с нанесенным на них реа- 
гентом инкубируют во влажной камере (в чашке Петри) при температуре 
37±0.5 °С в течение 30 мин, периодически проверяя их состояние во избе- 
жание высыхания реагента на препарате, что может привести к ложнопо-
ложительным результатам при диагностике, поэтому высохшие препараты 
бракуются.

4.2.4 Промывание предметных стекол. По истечении срока инкубации 
предметные стекла тщательно промывают дистиллированной водой в те- 
чение 10с, остатки воды удаляют с краев стекла фильтровальной бума- 
гой и высушивают на воздухе.

4.2.5. Микроскопирование мазков. На мазок наносят 20 мкл жидкости 
для "заключения" препарата (компонент №3), покрывают обезжиренным 
покровным стеклом и просматривают препарат в люминесцентном микро- 
скопе при комбинации светофильтров СЗ 24-3, ФС 1-2, БС 8-3 при исполь- 
зовании окуляра Х 10 и объектива с масляной иммерсией Х 90, с использо- 
ванием нефлюоресцирующего иммерсионного масла. Препарат рекомен- 
дуется просматривать сразу же после приготовления. Смонтированные 
препараты можно хранить при температуре 2-8 °С не более 24 ч.