Продолжение
Таблица 1
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА
(по первому ряду пробирок).
Компоненты
|
Номера пробирок
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
Комплемент в разведении 1:20
|
0,02
|
0,04
|
0,06
|
0,08
|
0,10
|
0,12
|
0,14
|
0,16
|
0,18
|
0,2
|
Физиологический раствор
|
0,18
|
0,16
|
0,14
|
0,12
|
0,10
|
0,08
|
0,06
|
0,04
|
0,02
|
-
|
Антиген специфический в рабочем титре
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
Сыворотка в разведении 1:5
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
Водяная баня 30 мин.при 37-38 гр.С
|
Гемолитическая система
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
Водяная баня 20 мин.при 37-38 гр.С
|
Дополнительный ряд пробирок для предварительного разведения комплемента..
|
Комплемент 1:20
|
0,2
|
0,4
|
0,6
|
0,8
|
1,0
|
1,2
|
1,4
|
1,6
|
1,8
|
2,0
|
Физиологический раствор
|
1,8
|
1,6
|
1,4
|
1,2
|
1,0
|
0,8
|
0,6
|
0,4
|
0,2
|
-
|
Таблица 2
СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА КОМПЛЕМЕНТА
(пример)
№№ пробирок
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
Дозы комплемента
в разведении 1:20
|
0,02
|
0,04
|
0,06
|
0,08
|
0,10
|
0,12
|
0,14
|
0,16
|
0,18
|
0,2
|
Позитивная сыворотка
1 ряд
2ряд
|
++++
++++
|
++++
++
|
++++
+
|
++++
+
|
++++
-
|
++++
-
|
++++
-
|
+++
-
|
++++
-
|
++++
-
|
Сыворотка №1 из опыта
1 ряд
2 ряд
|
++++
++++
|
++++
++
|
++++
+
|
++++
-
|
++++
-
|
+++
-
|
+++
-
|
++
-
|
+
-
|
+
-
|
Сыворотка №2 из опыта
1 ряд
2 ряд
|
+++++
+
|
+++
++
|
++
+
|
+
-
|
-
-
|
-
-
|
-
-
|
-
-
|
-
-
|
-
-
|
Таблица 3
СХЕМА ГЛАВНОГО ОПЫТА РСК
Компоненты реакции
|
№№ пробирок
|
Контроли
|
1
|
2
|
3
|
4
|
антиген специфический
|
антиген контрольный
|
гемолити-
ческая
система
|
разведение сыворотки
|
на анти-
компле-
ментарность
|
на гемо-
токсичность
|
на анти-
компле-
ментарность
|
на гемо-
токсичность
|
1:5
|
1:5
|
1:5
|
1:10
|
Испытуемая сыворотка
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Физиологический раствор
|
0,2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
0,2
|
-
|
0,2
|
0,6
|
Контрольный антиген
|
-
|
0,2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
0,4
|
0,4
|
-
|
Специфический
антиген
|
-
|
-
|
0,2
|
0,2
|
0,4
|
0,4
|
-
|
-
|
-
|
Комплемент в рабочем титре
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
-
|
0,2
|
-
|
-
|
Водяная баня 30 мин. при 37-38 гр.С
|
Гемолитическая система
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
Водяная баня 20 мин. при 37-38 гр.С
|
Результат реакции (положительный)
|
-
|
-
|
++++
|
++++
|
-
|
++++
|
-
|
++++
|
++++
|
Таблица 4
СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАБОЧЕГО РАЗВЕДЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТА ДЛЯ РДСК
Компоненты реакции
|
№№ пробирок
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
разведение комплемента
|
1:10
|
1:10
|
1:20
|
1:30
|
1:40
|
1:50
|
1:60
|
1:70
|
1:80
|
1:90
|
Комплемент чистый
|
0,2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Физиологический раствор
|
1,8
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Комплемент 1:10 из 1-й пробирки
|
-
|
0,2
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
Физиологический раствор
|
-
|
-
|
0,1
|
0,2
|
0,3
|
0,4
|
0,5
|
0,6
|
0,7
|
0,8
|
из пробирок удаляют лишнее количество, доводя до объема 0,2
|
-
|
-
|
-
|
0,1
|
0,2
|
0,3
|
0,4
|
0,5
|
0,6
|
0,7
|
Комплемент в разведениях
|
.
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
Физиологический раствор
|
.
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
Гемолитическая сыворотка
|
.
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
0,4
|
водяная баня 10-15 минут
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ЧГ
|
ЧГ
|
НГ
|
НГ
|
В примере - полный гемолиз при разведении комплемента 1:50, а рабочее
разведение берут в 2 раза меньше,
т.е.1:25.
Таблица 5
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
Компоненты реакции
|
Ряды пробирок
|
№№ пробирок
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
Позитивная, негативная или
испытуемая сыворотка в разведении 1:5
|
первый
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
второй
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
Физиологический раствор
|
первый
|
-
|
.
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
второй
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
Специфический антиген
|
первый
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
второй
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Комплемент в рабочем разведении
(1:25, 1:30)
|
первый
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
второй
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
Холодильник 16-18 часов при 37-38 гр.С.
|
Гемолитическая система
|
первый
|
0,1
|
0,2
|
0,3
|
0,4
|
0,5
|
0,6
|
0,7
|
0,8
|
0,9
|
1,0
|
второй
|
0,1
|
0,2
|
0,3
|
0,4
|
0,5
|
0,6
|
0,7
|
0,8
|
0,9
|
1,0
|
Водяная баня 20 минут при 37-38 гр.С.
|
Примерный результат по негативной сыворотке
|
первый
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ЧГ
|
ЧГ
|
ЧГ
|
ЧГ
|
второй
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ПГ
|
ЧГ
|
ЧГ
|
ЧГ
|
ЧГ
|
Таблица 6
СХЕМА ГЛАВНОГО ОПЫТА РДСК
Компоненты реакции
|
№№ пробирок
|
Контроли
|
1
|
2
|
3
|
4
|
Антиген специфический
|
Антиген контрольный
|
Гемолитическая
система
|
разведение сыворотки
|
на антикомпле-
ментарность
|
на гемоток-
сичность
|
на антикомпле-
ментарность
|
на гемоток-
сичность
|
1:5
|
1:5
|
1:5
|
1:10
|
Испытуемая сыворотка
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
-
|
Физиологический раствор
|
0,2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
0,2
|
-
|
0,2
|
0,6
|
Контрольный антиген
|
-
|
0,2
|
-
|
-
|
-
|
-
|
0,4
|
0,4
|
-
|
Специфический антиген
|
-
|
-
|
0,2
|
0,2
|
0,4
|
0,4
|
-
|
-
|
-
|
Комплемент в рабочем разведении
(1:25; 1:30)
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
0,2
|
-
|
0,2
|
-
|
-
|
Холодильник 16-18 часов при 2-6 гр.С и 20-30 минут прикомнатной температуре
|
Гемолитическая система
|
0,6
|
0,6
|
0,6
|
0,6
|
0,6
|
0,6
|
0,6
|
0,6
|
0,6
|
Водяная баня 20 минут при 37-38 гр.С
|
Результат реакции
(положительный)
|
-
|
-
|
++++
|
++++
|
-
|
++++
|
-
|
++++
|
++++
|
3. Постановка ИФА
3.1. ИФА применяют для ретроспективной диагностики хламидиозов животных и
эпизоотологического обследования поголовья путем выявления специфических
антител в сыворотках крови больных животных.
3.2.Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и
антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового
иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызвать разложение суб-
страта с образованием цветного продукта ферментативной реакции.
3.3. Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудование:
3.3.1. В состав набора входят:
1-специфический антиген хламидиозный, лиофилизированный -1 амп.;
2-специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;
3-отрицательная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;
4-пероксидазный антивидовой конъюгат, лиофилизированный -1 амп.
Химический набор, в состав которого входят:
5-КН2Р04-1 амп.;
6-К2НР04-1 амп.;
7-NaCl-1 амп.;
8-Твин-20 (-40,-80, Тритон Х-100) -1 амп.;
9-лимонная кислота -1 амп.;
10-КН2Р04-1 амп.;
11-0-фенилендиамин - 2 амп.;
12-гидроперит -1 табл.;
13-две 96-луночные полистироловые планшеты с плоским дном для ИФА;
14-стоп-раствор -1 флакон.
3.3.2. Оборудование:
1- одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом от
0,05 куб.см до 1 куб.см;
2 - стеклянные пипетки на 1-2 куб.см;
3 - промывающее устройство;
4 - спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм.
3.4. Приготовление рабочих растворов:
- Буфер №1 - (0,01 М калий фосфатный, рН 7,2-7,4) предназначен для рас-
творения антигена. Содержимое ампул 5,6,7 растворяют в 2500 куб.см
дистиллированной воды, фильтруют, проверяют рН. При необходимости рН
корректируют 0,1 N КОН или НСl.
- Буфер №2 - предназначен для растворения сывороток, конъюгата, а также
для промывки микропанелей. К 2000 куб.см буфера №1 добавляют содержимое ам-
пулы №8.
- Буфер №3 - (фосфатно-цитратный) предназначен для приготовления суб-
страта (рН 5,0-5,2). Состоит из двух компонентов: растворов А и Б.
А - содержимое ампулы №9 растворить в 50 куб.см дистиллированной воды в
мерной колбе.
Б - содержимое ампулы №10 растворить в 50 куб.см дистиллированной воды в
мерной колбе, затем к 24,3 куб.см раствора А добавить 25,7 куб.см раствора
Б и 50 куб.см дистиллированной воды, проверить рН. В случае необходимости
добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) компоненты
буфера до установления требуемого рН. Изменение цвета субстратного
раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является следствием
использования для его приготовления недостаточно чистой посуды. В таком
случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно перед
использованием, хранению не подлежит.
Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непосредственно
перед употреблением. Применяют для цветного проявления реакции на по-
следней стадии. Содержимое ампулы №11 растворить в 2 куб.см спирта-
ректификата и добавить 48 куб.см буфера №3, внести 0,8 куб.см перекиси
водорода, полученной путем растворения 1 таблетки №12 в 10 куб.см
дистиллированной воды.
Буферные растворы хранят при температуре 4-6 °С не более 3 мес.
3.4.2. Подготовка биологических компонентов реакции:
Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 20 куб.см буфера
№1.
Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 куб.см буфера
№2.
Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 куб.см буфера №2,
получая разведение 1:200.
Растворенный антиген, сыворотки, антивидовой конъюгат хранят при 4-6 °С
в течение 3-4 дней.
3.4.3. Разведение проб сыворотки крови.
Испытуемую сыворотку крови разводят 1:200 буфером №2 в отдельных пробирках
или микропанели.
3.5. Постановка иммуноферментной реакции.
Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.
3.5.1. Сорбция антигена на микропанели.
3.5.2. Промывание микропанели.
Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Каждую лунку
заполняют буфером №2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхивают. Промывание
повторяют 4-5 раз.
Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое промывающее
устройство.
3.5.3. Разведение сывороток.
В три лунки микропанели вертикального ряда А1, В1, С1 вносят по 0,1 куб.см
специфической положительной сыворотки (положительный контроль), а в три
следующик лунки D1, Е1, F1 вносят по 0,1 куб.см отрицательной сыворотки
(отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены согласно п. 3.4.2. В
лунки G1, Н1, которые служат контролем субстрата, вносят по 0,1 куб.см
буфера №2. В горизонтальные ряды А, Е вносят, начиная с лунок А2 и Е2 по
0,2 куб.см исследуемых парных проб сыворотки, подготовленных как указано в
п. 3.4.3 и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с
разведения 1:200 до 1:6000.
Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37 °С в термостате в
течение часа.
3.5.4. Внесение конъюгата.
Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.
Во все лунки вносят по 0,1 куб.см рабочего раствора иммуноферментного ко-
нъюгата, подготовленного согласно п. 3.4.2, и инкубируют в термостате при
37 °С в течение 1 часа.
3.5.5. Промывают 5 раз как указано в п.3.5.2.
3.5.6. Проявление реакции.
Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4.1.
Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 см3 субстратно-индикаторного
раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30-40 мин.
В каждую лунку вносят по 100 мкл стоп-раствора.
3.6. Учет результатов реакции.
Результаты учитывают в течение 30-40 мин. после внесения стоп-раствора.
3.6.1. Визуальный учет: при наличии специфических антител наблюдается
оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле.
Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое
пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.
3.6.2.Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции про-
водят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 490
нм. Результат выражают в единицах оптической плотности (ОП490).
Положительными считаются пробы, ОП490 которых в два и более раза пре-
восходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом
не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.
Сомнительные пробы - ОП490 которых выше отрицательного контроля и со-
ставляют 0,150-0,199 оптических единиц.
Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свидетельст-
вует об отрицательной реакции.
3.7. Интерпретация результатов ИФА.
Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз явля-
ется увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При
этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических
и патологоанатомических признаков заболевания.
Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и
при подтверждении первоначального результата считаются положительными.
3.8. Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и
сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики
для постановки окончательного диагноза.
.gif)
.gif)