МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ
1. Общие положения.
2. Схема проведения лабораторных исследований.
3. Отбор и подготовка проб к исследованию.
4. Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммуно-флуоресценции
в мазках-отпечатках.
5. Выделение эпизоотического вируса КЧС из патологического материала
инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15)
и идентификация его реакцией прямой иммунофлуоресценции.
6. Обнаружение специфических антител в сыворотках крови переболевших
классической чумой свинец реакцией нейтрализации флуоресцирующих
микробляшек и реакцией непрямой иммунофлуоресценциии.
7. Выделение н идентификация вируса КЧС биопробой на животных.
8. Постановка лабораторного диагноза.
9. Срок исследований.
Приложение
1. Материалы и реактивы для постановки реакции прямой и непрямой
иммунофлуоресценции.
2. Поддержание и выращивание перевиваемой культуры клеток
почки поросенка (РК-15).
3. Титрование и определение инфекционной активности вируса КЧС.
4. Приготовление тест-препаратов для постановки РНИФ.
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОСCИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
№ 13-4-2/809 от 30 декабря 1996 г. В.В.Селиверстов
Методические указания
по лабораторной диагностике
классической чумы свиней
1.Общие положения
1.1.Лабораторная диагностика классической чумы свиней (КЧС) основана на:
обнаружении антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в
клетках мазков-отпечатков проб органов;
выделении эпизоотического вируса КЧС из патологического материала иноку-
ляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15) н его
идентификации реакцией прямой иммунофлуоресценции;
обнаружении специфических антител в сыворотках крови переболевших класси-
ческой чумой свиней реакцией нейтрализации флуоресцирующих микробляшек
или реакцией непрямой иммунофлуоресценциии;
выделении и идентификации вируса КЧС биопробой на животных.
Для постановки иммунофлуоресцентных реакций используют "Набор
препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней".
1.2. При проведении лабораторной диагностики руководствуются "Правилами
работы и охраны труда в ветеринарных лабораториях", утвержденными Мини-
стерством сельского хозяйства СССР 14 января 1975 года.
2. Схема проведения лабораторных исследований
2.1. Отбор проб органов и подготовка патологического материала для
исследования.
2.2. Приготовление мазков-отпечатков для постановки реакции прямой
иммунофлуоресценции и экстрактов проб исследуемых органов для инокуляции
культуры клеток (проводится одновременно).
2.3. Постановка реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) с целью обнаруже-
ния специфического антигена вируса КЧС в мазках-отпечатках из проб органов.
По положительным или отрицательным результатам реакции ставят предваритель-
ный диагноз.
2.4. Инокуляция культуры клеток РК-15 экстрактами суспензий проб исследуе-
мых органов с последующей постановкой РПИФ для обнаружения и идентификации
эпизоотического вируса КЧС.
2.5. Исследование сывороток крови свиней в реакции нейтрализации флуо-
ресцирующих микробляшек (РИФМ) или реакции непрямой иммунофлуо-
ресценции (РНИФ). Серологические исследования проводят в тех случаях, когда
пробы крови получены от свиней, подозреваемых в переболевании классической
чумой (ретроспективные исследованиям из хозяйства не применяющих вакцинацию
против КЧС в течение последних 2-х лет.
2.6. Постановку биопробы проводят только по указанию Департамента ветерина-
рии, когда при подозрении на КЧС на основании эпизоотологического обследо-
вания, получены отрицательные результаты лабораторных исследований.
3. Отбор и подготовка проб к исследованию.
3.1.Для исследования берут лимфатические узлы (подчелюстные и мезентериаль-
ные), части миндалин, селезенки, легкого, почки, кровь и костный мозг (из
грудной или трубчатой кости) от 3-5 животных, убитых в стадии агонии или не
позже чем через 2-3 ч. после гибели.
3.2. Пробы отбирают в стерильные флаконы массой 5-10 г каждой, герметически
укупоривают резиновыми пробками.
Флаконы с наружи обрабатывают 5%-ным раствором едкого натра или осветленным
20%-ным раствором хлорной извести, обертывают марлей, смоченной тем же
раствором, угадывают в полиэтиленовый пакет и помещают в термос со льдом. В
случае длительной транспортировки (более 2 сут.) пробы органов заморажива-
ют. Термос помещают в металлический контейнер, опечатывают и доставляют на-
рочным в лабораторию с сопроводительным документом.
3.3. При ретроспективной диагностике направляют 5-10 проб крови (по 5-8
куб. см) от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой. Кровь
берут не ранее 15-20 сут. после установления признаков болезни.
3.4. В лаборатории пробы селезенки, лимфатических узлов, легкого, почки
каждого животного очищают от жировой и соединительной тканей и готовят по
2 мазка-отпечатка каждого органа для РПИФ. Для этого обезжиренные спирт-
эфиром (1:1) покровные стекла укрепляют в расщепах деревянных палочек с
условными номерами и делают мазок-отпечаток, прикладывая стекло к поверхно-
сти среза исследуемого органа (каждый отпечаток делается новым срезом орга-
на). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе при комнатной температуре (ЗО-60
мин.) и помещают в химический стакан с холодным (2-4гр.С) ацетоном. Фикса-
цию проводят в камере бытового холодильника при 4 (±2) гр.С в течение 10-15
мин. Затем мазки-отпечатки извлекают из ацетона, высушивают и используют
для постановки РПИФ. Хранят мазки-отпечатки при 4 (+-)гр.С не более 3 сут.
Контрольные отрицательные мазки-отпечатки готовят заранее, используя
пробы органов от здоровых животных.
3.5. Навески каждого органа (примерно по 2 г) отдельно растирают в ступке
со стерильным порошком из стеклам или песком и готовят 20%-ную суспензию на
стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Приготовленные суспензии
дважды замораживают при минус 10-12 гр.С оттаивают при 3О-37 гр.С и центри-
фугируют в рефрижераторной центрифуге при 2500 - 3000 об/мин в течение 10-
15 мин. Надосадочную жидкость (экстракт) отсасывают, вносят 100 ЕД/куб.см
пенициллина и 100 мг/куб.см стрептомицина (конечная концентрация), выдержи-
вают 1 ч. при 37(±0,5)гр.С и готовят разведения 1:5 и 1:10 на стерильном
0,85 %-ном растворе хлористого натрия. Для инокуляции культуры клеток ис-
пользуют как исходные (неразведённые) экстракты, так и разведенные.
3.6.Для получения сыворотки пробы крови выдерживают 1 ч. в термостате
при 37(±0,5)гр.С или при комнатной температуре до образования сгустка. Сгу-
сток обводят и пробы переносят в камеру бытового холодильника на 10-14 ч.
Сыворотку отсасывают и используют для исследования.
4.Обнаружение антигена вируса КЧС реакцией прямой иммуно-
флуоресценции в мазках-отпечатках.
4.1.Содержимое ампулы ФИТЦ - иммуноглобулинов КЧС растворяют 0,5 куб.см
дистиллированной воды и готовят рабочее разведение препарата на 0,01 М фос-
фатно-солевом буферном растворе - ФСБ (приготовление буферного раствора в
Приложении, п.1.), указанное на ампуле.
4.2. Препараты мазков-отпечатков, приготовленные по п.3.4., помещают на ка-
пли ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС, нанесенные в рабочем разведении на края
предметных стекол, находящихся во влажной камере, и выдерживают при
57(±0,5)гр.С в течение 30 мин.
4.3. Препараты снимают с предметных стекол, ополаскивают ФСБ и свободными
концами спичек укрепляют в гнездах отмывочного штатива. Штатив помешают в
цилиндрическую банку с раствором ФСБ, установленную на магнитную мешалку.
Отмывание мазков-отпечатков от несвязавшихся или неспецифически связавшихся
ФИТЦ-иммуноглобулинов ведут в течение 20 мин в темном месте, сменяя буфер-
ный раствор через 10 мин.
4.4. После отмывания препараты ополаскивают дистиллированной водой, подсу-
шивают на воздухе и помещают на капли нефлуоресцирующего глицерина, разве-
денного раствором ФСБ в соотношении 9:1, нанесенные на прозрачные обезжи-
ренные предметные стекла. Края препаратов заливают расплавленным парафином.
4.5. Люминесцентную микроскопию препаратов проводят в сине-фиолетовом свете
при освещении их сверху, через объектив на микроскопах типа "ЛЮМАМ". Возбу-
ждающий светофильтр ФС-1-2 или СС-15-2; запирающий ЖС 18+ ЖЗС-19. Препараты
последовательно просматривают при увеличении 7х10, 7х40 ("сухая" микроско-
пия ), затем, при необходимости, в иммерсионной системе при увеличении
7х90, используя неразведенный нефлуоресцирующий глицерин.
4.6. Специфическую флуоресценцию учитывают в лнмфоидных клетках паренхимы
селезенки, лимфатических узлов, легкого, расположенных группами, а также в
эпителиальных клетках миндалин и клетках эпителия почечных канальцев, рас-
положенных группами. Флуоресценцию обнаруживают в виде яркого, зеленого,
диффузного свечения цитоплазмы антигенсодержащих клеток.
4.7. Учет и оценка результатов.
Проводят по условной четырёхкрестовой шкале при увеличении 5х40:
(++++,+++,++,+) обнаружение во всех полях зрения множества групп клеток с
яркой зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат положительный,
( ± ) обнаружение в 5-10-ти полях зрения единичных групп, состоящих из 3-5
клеток с зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат сомнитель-
ный,
- отсутствие в мазках-отпечатках клеток с цитоплазматической флуоресценци-
ей. Свечение клеток тускло-зеленое - результат отрицательный.
Отдельно расположенные клетки с флуоресценцией цитоплазмы или ядра не учи-
тывают.
5. Выделение эпизоотического вируса КЧС из патологического материала
инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15)
и идентификация его реакцией прямой иммунофлуоресценции.
5.1. Подготовленные для исследования экстракты 20 %-ных суспензий проб ор-
ганов (п.3.5.) вносят по 0,5-0,6 куб.см в пробирки с культурой клеток РК-
15, выращенной на стеклянных пластинках из покровных стекол, (выращивание
культуры клеток РК-15 в Приложении п.2), предварительно удалив ростовую
среду. Для инокуляции суспензии каждого органа берут не менее 8 пробирок.
Пробирки помещают в термостат 37 (±0,5)гр.С на 2 ч. По истечении указанного
времени инокулюм удаляют, монослой клеток однократно промывают средой Иг-
ла(МЕМ) без сыворотки. Затем в пробирки вносят по 2,0 куб.см питательной
среды, содержащей 2 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота, (поддер-
живающая среда) и инкубируют 24-96 ч. Через 24 ч после инокуляции поддержи-
вающую среду меняют на свежую. В качестве контроля культуры клеток (отрица-
тельные препараты) 8 пробирок оставляют интактными, предварительно сменив
ростовую среду на поддерживающую.
5.2. Каждые 24 ч по 2 пластинки с культурой клеток, инокулированной ис-
ледуемым экстрактом суспензии каждого органа, извлекают из пробирок, встав-
ляют в расщепы спичек с номерами, обсушивают на воздухе до полного удаления
влаги и фиксируют холодным ацетоном в течение 10 мин. (п.3.4.).
5.3. С препаратами, приготовленными по п.5.2., ставят РПИФ и проводят люми-
несцентную микроскопию (п.п. 4.2.- 4.5.).
5.4. Оценка результатов.
5.4.1. При обнаружении специфической желто-зеленой или зеленой диффузной
флуоресценции в цитоплазме клеток, расположенных группами ("флуоресцирующие
микробляшки") и отсутствии ее в отрицательных препаратах, вирус КЧС считают
выделенным и идентифицированным, а результат положительным.
5.4.2. В случае обнаружений тусклой, диффузной зеленой флуоресценции в
клетках препаратов и отсутствии "флуоресцирующих микробляшек" после 96-
часовой инкубации, проводят 2 дополнительных пассажа.
Для этого, пробирки с инокулированной культурой 1-го пассажа, взятые через
96 ч культивирования (п.5.1.) дважды замораживают при минус 10-12 гр.С, от-
таивают при 30-37гр.С и культуральную жидкость используют в качестве иноку-
люма для проведения 2-го пассажа (п.п.5.1.- 5.4.). 3-й пассаж проводя ана-
логично.
В случае отсутствия "флуорецирующих микробляшек" в третьем пассаже резуль-
тат считают отрицательным.
6.Обнаружение специфических антител в сыворотках крови переболевших
классической чумой свинец реакцией нейтрализации флуоресцирующих
микробляшек и реакцией непрямой иммунофлуоресценциии.
6.1. Постановка реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РИФМ).
6.1.1. Исследуемые сыворотки и контрольные (специфическую и нормальную сы-
воротки, взятые "Набора препаратов", перед постановкой реакции растворяют
0,5 куб.см дистиллированной воды), прогревают при 56 гр.С 50 мин. и разве-
дет в пенициллиновых флаконах средой Игла (МЕМ) 1:8 (к 0,2 куб.см сыворотки
добавляют 1,4 куб.см среды).
6.1.2. Во флаконы с разведенными сыворотками вносят равный объем 1000 ККИД
50/куб.см вируса КЧС, шт. "Ши-Мынь", (титрование вируса и расчет рабочей
дозы вируса в Приложении п. 3), тщательно встряхивают и инкубируют в тече-
ние 60 мин в термостате при 37(+-5)гр.С.
6.1.3. После инкубации по 0,5 куб.см смеси вносят в пробирки с выращенной
культурой клеток РК-15 на стеклянных пластинках, предварительно удалив рос-
товую среду.На каждую сыворотку берут по 4 пробирки. В качестве контроля
токсичности разведенные сыворотки без вируса в объеме 0,5 куб.см вносят в 4
пробирки и 4 пробирки оставляют интактными, сменив ростовую среду на под-
держивающую ("контроль культуры клеток").
6.1.4. Через 2 ч смесь из пробирок удаляют, монослой дважды промывают сре-
дой Игла (МЕМ) и заливают поддерживающую среду. Каждые 24 ч культуру клеток
просматривают под малым увеличением светового микроскопа для контроля деге-
нерации клеток.
6.1.5. При отсутствии дегенеративных изменений клеток через 48 ч после вне-
сения смесей пластинки извлекают из пробирок, готовят препараты ( п.5.2.),
ставят реакцию прямой иммунофлуоресценции (п.4.2-4.4) и проводят люминес-
центную микроскопию (п.4.5.).
6.1.6. Оценка результатов
Результаты начинают оценивать в том случае, если в препаратах, об-
работанных смесью "нормальная сыворотка-вирус", обнаруживают флуоресци-
рующие микробляшки при их отсутствии в препаратах, обработанных смесью"
специфическая сыворотка-вирус".
При отсутствии флуоресцирующих микробляшек в препаратах, обработанных сме-
сью "исследуемая сыворотка-вирус", результат считают положительным, в слу-
чае обнаружения - отрицательным.
6.2. Постановка реакции непрямой иммунофлуоресценцин (РНИФ).
6.2.1. Положительные и отрицательные тест-препараты (приготовление в
Приложении п. 4) помещают на капли исследуемых и контрольных (специ-
фической и нормальной) сывороток, разведенных 1: 20, нанесенные на края
предметных стекол во влажной камере. На каждую сыворотку берут по 2 положи-
тельных и отрицательных тест-препаратов. Обработку тест-препаратов сыворот-
ками проводят при 37(±0,5)гр.С в течение 30 мин.
6.2.2. Отмывание тест-препаратов от несвязавшихся антител проводят по
п.4.3.
6.2.3. Тест-препараты слегка подсушивают н помещают на капли раствора ФИТЦ-
иммуноглобулинов антисвиных в рабочем разведении, нанесенные на края пред-
метных стекол во влажной камере. Обработку тест-препаратов ФИТЦ-
иммуноглобулинами антисвиными проводят при 37(±0,5)гр.С в течение 30 мин.
6.2.4. Отмывание тест-препаратов от несвязавшихся ФИТ-нммуноглобулинов ан-
тисвиных, подготовку препаратов для люминесцентной микроскопии и микроско-
пию проводят по п.п.4.3 - 4.5.
6.2.5.Оценка результатов
Проводят по интенсивности свечения антигенсодержащих клеток флуоресцирующих
микробляшек положительных и отрицательных тест-препаратов, обработанных ис-
следуемыми и контрольными сыворотками:
- яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирусспецифических антигенов
в зараженных клетках положительных тест-препаратов, обработанных ис-
следуемыми и контрольными сыворотками:
- яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирусспецифических антигенов
в зараженных клетках положительных тест-препаратов, обработанных иссле-
дуемыми сыворотками - результат положительный;
-тусклое зеленое свечение в клетках положительных тест-препаратов - резуль-
тат отрицательный.
В положительных тест-препаратах, обработанных специфической сывороткой на-
блюдают яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирусспецифнческих ан-
тигенов в зараженных клетках и отсутствие подобного свечения в специфиче-
ских тест-препаратах, обработанных нормальной сывороткой: в отрицательных
тест-препаратах, обработанных специфической и нормальной сыворотками наблю-
дают тусклое зеленое свечение цитоплазмы клеток.
7. Выделение н идентификация вируса КЧС биопробой на животных.
7.1. Для постановки биопробы используют 4-х здоровых поросят 2-4 месячного
возраста, полученных от свиноматок, не вакцинированных против КЧС и не со-
держащих в сыворотке крови специфических антител к вирусу КЧС, и 2-х поро-
сят такого же возраста, иммунных против КЧС. Для иммунизации поросятам вво-
дят по 1000 ИмД 5о/куб.см вирусвакцины ЛК ВНИИВВиМ против классической чумы
свиней и через 10-15 сут. после прививки используют для постановки биопро-
бы.
7.2. Животных помещают в разные боксы по два подсвинка в каждый станок.
7.3. Двух неиммунных подсвинков содержат в отдельном помещении в качесте
контрольных.
7.4. Содержание и кормление животных должны соответствовать зоотехническим
нормам.
7.5. Непосредственно перед введением готовят экстракты 20%-ных суспензий
лимфатических узлов и селезенки подозреваемых в заболевании классической
чумой свиней (п.3.5.) и фильтруют через фильтр "Миллипор" (или его аналог)
с величиной пор 0,22-0,48 мкм.
Равные объемы экстрактов органов смешивают, при этом общий объем смеси дол-
жен быть не менее 20 куб.см.
7.6. Подготовленный материал вводят 2-м восприимчивым и 2-м иммунным живот-
ным внутримышечно, соблюдая правила асептики, с внутренней стороны бедра в
количестве 3-5 куб.см каждому поросенку. За животными ведут клиническое на-
блюдение с ежедневным измерением температуры тела в течение 15 сут.
7.7. 0ценка результатов.
7.7.1. При повышении температуры тела у невакцинированных поросят до 40,5-
42гр.гр.С, угнетении, отсутствии аппетита через 3-5 сут. после введения ис-
следуемого материала, на 5-10 сут. после повышения температуры тела выше
нормы проводят убой поросят и отбор проб органов (п.3.1.), их подготовку
(п.3.5.)и исследование (п.п.5.1.-5.4.)с целью реизоляции и идентификации
вируса КЧС. При выделении и идентификации вируса, результат биопробы счита-
ют положительным.
7.7.2. При установлении заболевания и гибели невакцинированных и
вакцинированных против КЧС поросят, проводят дифференциальные лабораторные
исследования на африканскую чуму свиней.
8.Постановка лабораторного диагноза.
Диагноз на классическую чуму свиней считают установленным в случае:
- выделения и идентификации вируса КЧС в одной из исследуемых проб органов,
- выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных из
хозяйства не применяющих вакцинацию против КЧС в течение последних 2-х лет,
- получения положительных результатов биопробы на животных, реизоляции и
идентификации вируса.
9. Срок исследований:
вирусологических - 2-12 сут,
серологических - 1-2 сут,
биопроба - 12-24 сут.
Приложение
к Методическим указаниям
по лабораторной диагностике
классической чумы свиней
1. Материалы и реактивы для постановки реакции прямой и непрямой
иммунофлуоресценции.
1.1. Предметные стекла по ГОСТ 9284-75, обезжиренные спирт-эфиром, взятыми
в соотношении 1:1.
1.2. Влажная камера (чашка Петри) или стерилизатор с увлажненной фильтро-
вальной бумагой.
1.3. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСК) 0.01 М рН 7.2 - 7.5 готовят,
смешивая:
а) 0,01 М раствор двузамещённого фосфата натрия (1,42 г Nа2 НРО4 безводного
или 1,78 г N2HPO4 x 2H2O) с 0,85% хлористого натрия, воды дистиллированной
до 1 куб.дм,
б) 0,00 М раствор однозамещённого фосфата калия (1,36 г КН2РО4) с 0,85%
хлористого натриям воды дистиллированной до 1 куб.дм.
Для приготовления 0,0 1М ФСБ с рН 7,2-7,4 смешивают 850 куб.см раствора "а"
с 250 куб.см раствора "б".
1.4. Штатив для отмывки препаратов. Изготавливают из пенопласта размером
1Ох10х2 см или из деревянной дощечки такого же размера.
1.5. Банка цилиндрическая по ГОСТ 23932-79 .
1.6. Нефлуоресцирующий глицерин или глицерин для люминесцентной микроскопии
(фирмы "Меrck" аrt.4095 или любой другой фирмы.
1.7. Парафин по ГОСТ 23683-79.
1.8. Магнитная мешалка любого типа.
1.9. "Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической
чумы свиней".
2.Поддержание и выращивание перевиваемой культуры клеток
почки поросенка (РК-15)
2.1. Работу проводят в изолированном, стерильном помещении. При одновремен-
ной работе с другими линиями клеток принимают меры для предотвращения кон-
таминации одной линии клетками другой.
2.2. Материалы, необходимые для поддержания и культивирования культуры
клеток РК-15.
Среда Игла(МЕМ), содержащая L-глутамин (300 мг на 1 куб.дм).
Сыворотка фекальная крупного рогатого скота (крс), не содержащая антител к
вирусу диареи крупного рогатого скота.
0,25% раствор трипсина.
0,02% раствор версена.
Пенициллин, стрептомицин.
Пробирки биологические.
Флаконы (матрасы) РУ.
Покровные стекла 18х18.
Стерильные центрифужные флаконы 100-500 куб.см.
Рефрижераторная низкоскоростная центрифуга.
2.3. Культивирование клеток.
2.3.1. Суспензию клеток готовят на среде Игла(МЕМ), содержащей 5-10% фе-
тальной сыворотки крупного рогатого скота, прогретой при 56(±2)гр.С в тече-
ние 30 мин - ростовая среда. Ростовую среду считают пригодной для работы,
если монослой формируется на 3-4 сут. при посадачной концентрации клеток
100 000 в 1 куб.см и объеме суспензии 100 куб.см /флакон РУ. Монослой кле-
ток долькой представлять собой единый пласт клеток с четким разделением
границ между ними. При наличии округлых клеток с вакуолями, включениями и
другими признаками цитопатологии данную партию культуры выбраковывают.
2.3.2. Пассаж (пересев) клеток проводят после образования сплошного моно-
слоя клеток. Для этого из матраса удаляют ростовую среду и вносят подогре-
тую до 37(+-0,5)гр.С смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного рас-
твора версена в соотношении 1:9. Матрас помещают в термостат на 5-7 мин.
Как только часть клеток начинает отслаиваться от стекла, 90-95% дисперги-
рующего раствора удаляют, добавляют небольшое количество ростовой среды и
матрацы энергично встряхивают до полного отделения клеток от стекла и берут
пробу суспензии для подсчета клеток. Суспензию клеток разводят ростовой
средой до концентрации 100 000 клеток/куб.см.К приготовленной суспензии
клеток добавляют антибиотики из расчета 100 ЕД/куб.см пенициллина и 100
мг/куб.см стрептомицина и разливают во флаконы РУ по 100 куб.см и по 2
куб.см в пробирки с покровными стеклами. Инкубируют при 37(±0,5)гр.С. В
случае неудовлетворительного роста клеток и формирования монослоя ростовую
среду меняют на свежую.
3. Титрование и определение инфекционной активности вируса КЧС.
-1 -6
Вируссодержащую культуральную жидкость, разведенную от 10 до 10
раствором Эрла или Хенкса, вносят в объеме 0,5 куб.см в пробирки с культу-
рой клеток РК-15, выращенной на покповных стеклах, при этом ростовую среду
предварительно удаляют. На каждое разведение вируссодержащего материала бе-
рут по 4 пробирки с хорошим монослоем.
После 2 ч контакта при 37(±0,5)гр.С вируссодержащий материал удаляют и
вносят по 2 куб.см поддерживающей среды и инкубируют 3 сут. при 37(±0,5)гр.
С. Затем пластинки из пробирок извлекают, высушивают, обрабатывают холодным
ацетоном. После фиксации ацетон с препаратов удаляют обсушиванием на возду-
хе (1-2 мин) и ставят РПИФ.
Титром вируса КЧС считают наибольшее его разведение, при котором обнаружи-
вают флуоресцирующие микробляшки или единичные клетки, содержано специфиче-
ский цитоплазматический антиген вируса. Вычесляют титр по методу Рида и
Менча (или его модификации), выражая его в клеточно-культуральньх 50%-ных
инфекционных дозах (КИИД 5о/объём).
4. Приготовление тест-препаратов для постановки РНИФ.
4.1. Перевиваемую культуру клеток почки поросенка (РК-15), выращенную на
покровных пластинках в пробирках , заражают стандартным вирусом КЧС (штамм
"Ши-Мынь") в дозе 0,001-0,0001 ККИД 5о/клетка в объеме 0,5 куб.см на про-
бирку, предварительно удалив ростовую среду, и помещают в термостат при
37(±0,5)гр.С на 2 ч. Затем, удалив вируссодержащую) жидкость вносят поддер-
живающую среду. Зараженную культуру клеток инкубируют в условиях термостата
при 37(±0,5)гр. С.
4.2. Через 48 часов инкубации, пластинки с зараженной культурой клеток из-
влекают, укрепляют в расщепы спичек, высушивают, обрабатывают холодным аце-
тоном в течение 10 мин и хранят в герметически закрытом контейнере при тем-
пературе минус 10-12гр.С. Отрицательные тест-препараты готовят аналогично,
исключая этап заражения культуры клеток.