ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1.
Методики подготовки проб органических удобрений и исследование их
на наличие индикаторных микроорганизмов.
1. После обеззараживания пробы подстилочного, твердой фракции и
полужидкого навоза отбирают с разных уровней навозохранилищ или буртов
по диагонали не менее 100 г из каждой точки в стерильную посуду. В
лаборатории навески проб растирают в фарфоровой ступке, добавляют 1:5-
10 стерильной водопроводной воды или физиологического раствора и
фильтруют через двойной слой марли.
Пробы навозных стоков и очищенных сточных вод отбирают с помощью
пробоотборников в стерильные флаконы (V - 500 мл) транспортируют и
хранят по общепринятым методикам.
Для исследований фильтрат навозных проб и сточные воды
центрифугируют при 3000 об/мин, центрифугат в объеме 1 мл вносят в
жидкие накопительные среды с последующим пересевом из пробирок, где
обнаружен рост, на плотные селективные среды.
Пробы навоза и стоков после дезинфекции химическими средствами
также фильтруют, фильтрат центрифугируют, центрифугат 2-3 раза
отмывают стерильным физиологическим раствором или водопроводной водой.
Отмытый осадок ресуспендируют в 1 мл стерильного физиологического
раствора или водопроводной воды высевают в жидкие элективные среды с
последующим пересевом на селективные плотные среды для индикации и
идентификации выделенных микроорганизмов.
2. Для индикации кишечной палочки центрифугат засевают в пробирки
с глюкозопептонной средой обьгчного состава и поплавками в соотношении
1:5 и инкубируют в термостате 24 ч при температуре 43гр. С.
Из каждой пробирки с глюкозопептонной средой, где отмечено
помутнение, образование газа и кислоты, делают посевы петлей штрихами
на поверхности среды Эндо в чашках Петри, разделенных на 3-4 сектора.
Посевной материал берут таким образом, чтобы получить изолированные
колонии. Чашки с посевами помещают в термостат крышками вниз и
инкубируют 18-20 ч при З7гр. С.
Типичные колонии кишечной палочки, выросшие на среде Эндо,
круглой формы, гладкие, выпуклые или с приподнятой в центре
поверхностью, с ровными краями, розового, красного или малинового
цвета с металлическим блеском или без него. Однако учитываются и
бесцветные колонии, так как дезинфектаны могут влиять на цвет колоний.
Из двух-трех разного типа колоний каждого сектора приготовляют
мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют, а также проверяют у них
оксидазную активность. Колонии грамотрицательных и оксидазонегативных
бактерий засевают в полужидкую среду с глюкозой и инкубируют 4-5 ч при
З7гр. С. Сбраживание сахара с образованием кислоты и газа указывает на
наличие кишечной палочки.
3. Для индикации стафилококков центрифугат в объеме 1 мл вносят в
солевой МПБ с 6,5% хлорида натрия в соотношении 1:5 и инкубируют
посевы в термостате в течение 24-48 ч при З7гр. С. Из пробирок, в которых
обнаружен рост бактерий, делают пересев на агар Чепмена в чашках Петри
и инкубируют посевы при тех же условиях. Из характерных круглых,
выпуклых и окрашенных колоний (белые, лимонного или оранжевого цвета)
с агара Чепмена готовят мазки, окрашивают их по Граму и
микроскопируют. Наличие в мазках грампозитивных кокков, расположенных
в виде виноградных гроздьев, говорит о присутствии стафилококков.
4. Индикацию энтерококков (Str.faeclis) осуществляют посевом
центрифугата в жидкую щелочно-полимиксиновую среду с последующим
пересевом из пробирок, в которых обнаружен рост бактерий, на плотную
глюкоза-дрожжевую среду с ТТХ. Посевы инкубируют при 37гр. С по 24-48 ч.
С глюкоза-дрожжевой среды отсевают на МПА характерные мелкие,
выпуклые с красным центром колонии для проверки биохимических свойств
по тестам Шермана (рост в МПБ с рН 9,6, солевого МПБ и др.). Наличие
характерных признаков указывает на присутствие энтерококков.
5. Для индикации спорообразующих аэробных микроорганизмов
фильтраты проб прогревают 30 мин на водяной бане при 65гр. С, затем
центрифугируют и осадок засевают в МПБ и на 2 чашки МПА. Посевы
инкубируют 24-48 ч при 37гр. С. Наличие колоний на МПА и помутнение МПБ
свидетельствует о присутствии спор аэробных микроорганизмов.
Продолжение
.gif)