ПРАВИЛА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ КОРМОВ (Утверждены Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйствя СССР 10 июня 1975 г.) 1. Отбор проб и составление среднего образца 2. Методы бактериологического исследования 2.1. Определение общего количества микробных клеток. 2.2.1. Метод последовательного обогащения. 2.3. Метол двойного центрифугирования. 2.4. Люминесцентный метод обнаружения сальмонелл. 2.5. Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки. 2.6. Исследования на анаэробы. 3. Оценка кормов Рецепты основных питательных сред 1.Селенитовая среда 2.Магниевая среда 2.1.Дрожжевой экстракт 3.Треxсахарный агар с мочевиной 4.Среда КОДА 5.Среда Китта-Тароцци 6.Кровяной агар по Цейслеру 7.Среда Вильсона-Блера Приложение 1.Основные дифференциальные признаки бактерий семейства ЕпtегоЬасtегiасеае Приложение 2.Морфологические и культуральные свойства анаэробов ПРАВИЛА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ КОРМОВ (Утверждены Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйствя СССР 10 июня 1975 г.) 1. Отбор проб и составление среднего образца 1.1. Настоящие правила регламентируют единые методы бактериологического исследования кормов животного и растительного происхождения, комбикормов и рыбной муки. 1.2. Отбор проб для бактериологического исследования при наличии затарен- ной продукции проводят согласно следующей таблице: ----------------------------------------------------------------------------- Объем партии в упаковочных единицах Отбор проб ----------------------------------------------------------------------------- До 10 От каждой упаковочной единицы От 10 до 100 От 10 упаковочных единиц От 101 и выше От 10 упаковочных единиц и дополнительно по 3 из каждых 100 упаковочных единиц П р и м е ч а и и е, 1 мешок = 1 упаковочной единице. 1.3. При наличии незатаренной продукции пробы берут не менее чем из 20 мест однородной партии со всей площади насыпи. Пробы можно отбирать в том же коли- честве с периодическими интервалами при погрузке и выгрузке из транспортных средств и бункеров. 1.4. Однородной партией считается количество корма, которое изготовляется по единой технологии в одну смену, затаренное в мешки или в незатаренном виде (насыпью) и доставленное одним видом транспорта. .1.5. Отбор проб проводят сухим, стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждой партии пробный щуп очищают и дезинфицируют. Масса первичной пробы должна быть не менее 100 г. 1.6. Для бактериологического исследования от каждой партии корма состав- ляют два средних образца весом не менее 500 г. Один из них направляют в лабора- торию, а другой сохраняют на предприятии (хозяйстве) до окончания исследования. 1.7. Для упаковки средних образцов применяют стерильную пластмассовую или стеклянную тару. 1.8. Об отборе проб составляют акты в двух экземплярах. Акты должны содер- жать следующие данные: название предприятия (хозяйства), вид продукции, объем (масса) партии, вид упаковки (тары), дату изготовления, дату отбора проб. 2. Методы бактериологического исследования 2.1. Определение общего количества микробных клеток. 2.1.1. В стерильную пробирку помещают 1 г корма, взятого из среднего об- разца (взятие корма для навески одноразовое), добавляют 9 мл физиологического раствора и тщательно встряхивают (получают разведение 1 : 10). Из полученной взвеси готовят последующие разведения (1 : 100, 1 : 1000, 1 10000, 1 ; 100000, 1 : 1 000 000). После оседания взвешенных частиц из верхнего слоя жидкости делают посевы. Для количественного учета микробного обсеменения в стерильные бактериоло- гические чашки вносят по 1 мл каждого разведения и заливают 10-15 мл стериль- ного, расплавленного и охлажденного до температуры 44-45 С мясо-пептонного. агара. Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 37 С. После 24-48-часового термостатирования проводят подсчет выросших колоний только в чашках, где содержатся не более 300 колоний. Результаты, полученные при подсчете колоний, умножают на разведения, суммируют и определяют количество микробов в 1 г корма. Например, в одной чашке оказалось 200 колоний, в другой - 21 и в третьей - 1. В эти чашки посев проводили из пробирок с разведениями соответственно - 1 : 10000, 1 : 100000, 1 : 1 000000. Следовательно, 1 г корма содержит: ї_200 10 000 + 21 X 100 000 + 1 X 1 000 000 3 =1,7 млн. микробов клеток. Определение общей бактериальной обсемененности мясо-костной муки можно проводить экспрессным методом с применением резазурина. Для этого в стерильную пробирку помещают 1 г мясо-костной муки, взятой из среднего абразия, добавляют 10 мл МПБ и встряхивают, а с другую пробирку для контроля вносят только 10 мл МПБ и помещают их в термостат при 40 С на 2 часа. После этого в пробирки добавляют по 1 мл 0,01%-ного раствора резазурина и вновь выдерживают в термостате в течение двух часов. Результаты реакции учитывают в этот период через каждые 30 минут. По вос- становлению резазурина (изменение окраски от синего до розового цвета) определяют общую микробную обсемененность мясо-костной муки. Если в пробирке с мясо-костной мукой наступает розовое окрашивание позднее 2 часов, это соответствует бактериальной обсемененности до 500 тыс. микробных кле- ток в 1 г продукта, а при окрашивании содержимого пробирки в розовый цвет до 2 часов - более 500 тыс. Контролем служит пробирка с 10 мл МПБ и 1 мл 0,01%-наго раствора резазу- рина, выдержанная в термостате при том же температурном режиме и экспозиции и без изменения цвета содержимого. 2.2.1. Метод последовательного обогащения. Навеску исследуемого материала 50-200 г (50 г от 10 н менее, 100 г от 10 до 100 и 200 г от 101 и выше упаковочных единиц) измельчают в стерильной фарфоровой ступке и вносят в колбу, содержащую среду предварительного обогащения (пептон- ная вода, МПБ с содержанием 5% маннита) при соотношении материала и среды 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и ставят в термостат при темпе- ратуре 37 С. Через 16-18 часов производят посевы на бактериологические чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами: висмут-сульфит агар, сре- дой Плоскирева или Левина (по две чашки) н на две (по выбору) основные среды обо- гащения (селенитовый бульон, магниевую среду, среды Киллиана, Мюллера, Кауф- мана) в соотношении 1:5. Лучшими являются селенитовый бульон и магниевая среда. После 16-18-часового выдерживания в термостате при 37 С из обогатительных сред бактериологической петлей производят вторично посевы на чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами, которые помещают в термостат при 37 С. Засеянные чашки просматривают через 16, 24, 48 часов. На висмут-сульфит агаре S.tурhi и S. рагаtурhi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром; S. сhоlегае suis - в виде зеленых коло- ний. Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричне- вого цвета с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, цвет участка среды под колонией черный. На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде прозрачных или нежно-розовых колоний, на среде Левина - в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розо- вато-фиолетовых колоний. В случае обнаружения колоний, подозрительных на сальмонеллы, 3-5 из них засевают на комбинированную среду Рассела или на двухсахарный (лактоза, глю- коза) агар, а лучше на трехсахарный (лактоза, глюкоза, сахарозам) "скошенный стол- бик" с мочевиной. Высев колоний из чашек также делают на короткий пестрый ряд, включающий скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой, а также на бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода (в этих целях под пробку про- бирки с бульоном вкладывают специальные индикаторные бумажки). Для опреде- ления подвижности культуры производят посев уколом в полужидкий агар (0,3- 0,5 %). На среду Рассела и "скошенный столбик" посевы делают сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. При разложении лак- тозы косая поверхность окрашивается в синий цвет (при индикаторе ВР). При раз- ложении одной глюкозы окрашивается только столбик среды и происходит разрыв агара со скоплением в нем пузырьков газа. При разложении мочевины в "скошенном столбике" окраска среды меняется на оранжевую при индикаторе ВР н на коричнево- фиолетовую при индикаторе тимоловый синий в сочетании с индикатором Андраде. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 С 16-18 часов. Культуры, ферментирующие лактозу, глюкозу и сахарозу с образованием газа и расщепляющие мочевину, отбрасывают. Культуры, не ферментирующие лактозу и сахарозу и не расщепляющие мочевину, подлежат дальнейшему исследованию. Изучают морфологию культуры в мазке, окрашенном по Граму, и подвижность (в висячей или раздавленной капле или в полужидком агаре). Культуры грамотрицательных подвижных палочек, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие моче- вину и не образующие индол, подвергаются серологическому исследованию в реак- ции агглютинации на предметном стекле с набором агглютинирующих сывороток. Для реакции агглютинации используют культуры, выращенные на среде Рас- села или на двухсахарном или трехсахарном агарах. При этом для реакции агглю- тинации с О-сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н-сыворотками - из самой нижней части (конденса- ционной воды), где микробы наиболее подвижны. Исследование культуры начинают реакцией агглютинации с поливалентной адсорбирозанной О-сывороткой основных серологических групп А, В, С, О, Е. На предметное стекло наносят каплю сыворотки и культуры, тщательно сме- шивают и в течение 2 мин. наблюдают склеивание (агглютинацию) частиц. Куль- туры, дающие положительную реакцию агглютинации с поливалентной сывороткой, также проверяют с монорецепторными агглютинирующими сыворотками. Сначала с помощью монорецепторных 0-сывороток устанавливают принадлежность культур к той или иной серологической группе, остановив серологическую группу, к которой отнесена данная культура, последнюю проверяют монорецепторными Н-сыворотками сначала первой фазы, а потом второй, определяя таким образом серологический тип бактерий в соответствии со схемой Кауфмана - Увита. 2.3. Метол двойного центрифугирования. 2.3.1. Первый день исследования. К 100 г исследуемого корма, помещенного в стерильную колбу, добавляют 500 мл физиологического раствора, энергично взбал- тывают в течение 5 минут и ставят в термостат при температуре 27 С. Через 6-8 ча- сов колбу вынимают из термостата, встряхивают, затем содержимое отстаивают в те- чение 5-10 минут. Набирают 20-25 мл надосадочной жидкости, вносят в 4 центри- фужные пробирки и центрифугируюг в течение 20 минут при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость из центрифужных пробирок сливают и к осадку доба- вляют среды обогащениям Киллиана, Мюллера, жидкую среду Плоскирева (но не менее двух). После тщательного перемешивания осадка со средой пробирки помещают в термостат при температуре 37 С на 5-6 часов для подращивания микрофлоры осадка. После этого пробирки вновь центрифугируют при тех же режимах. Из центрифужных пробирок производят посевы на плотные, дифференциально- диагностические среды: висмут-сульфит агар и среду Плоскирева, для чего из ка- ждой пробирки материал отбирают пастеровскими пипетками и вносят на 2-3 чашки по 1-3 капли и равномерно распределяют его шпателем по всей поверхности среды. Засеянные чашки помещают в термостат. К оставшемуся в центрифужных пробирках осадку добавляют ту же обогати- тельную среду, которая была удалена после центрифугирования, и продолжают ин- кубацию до следующего дня. Колбы с кормом после отбора необходимого количества материала оставляют в термостате также до следующего дня. 2.3.2. Второй день исследования. Из верхнего слоя обогатительных сред цент- рифужных пробирок (без встряхивания) и колб после 18-24-часового выдержива- ния в термостате при 37 С производят посевы на плотные среды. Затем просматри- вают посевы, произведенные в первый день исследования. С выросшими на плотных средах колониями, подозрительными на сальмонеллы, ставят реакцию агглютинации на предметных стеклах с поливалентной сальмонеллезной 0-сывороткой. Культуры, давшие положительную реакцию агглютинации, проверяют с монорецепторными 0-сыворотками и устанавливают принадлежность культур к той или иной серологи- ческой группе. Определение биохимических свойств культур проводят ускоренным методом, для чего применяют пастеровские пипетки, в которые насасывают каплю взвеси иссле- дуемой культуры, а затем небольшое количество тех или иных углеводов. Результаты учитывают по ферментации углеводов после выдерживания пипеток в термостате при 37 С в течение 2-3 часов. 2.3.3. Третий день исследования. Производят просмотр чашек с твердыми сре- дами, засеянными во второй день исследования, и проверяют биохимические и сероло- гические свойства выделенных культур для определения серологического типа бак- терий в соответствии со схемой Кауфмана - Уайта. 2.4. Люминесцентный метод обнаружения сальмонелл. 2.4.1. Из средней пробы берут 100 г корма, разводят стерильным физиологиче- ским раствором в соотношении 1:5 и выдерживают в термостате 6-8 часов при тем- пературе 37 С. Из полученной смеси готовят 2 мазка на обезжиренных стеклах нанесением суспензии бактериологической петлей на площадь 1 см2, обозначенную восковым карандашом на обратной стороне. Мазки высушивают на воздухе при ком- натной температуре или в термостате, фиксируют этиловым спиртом 15 минут и опо- ласкивают дистиллированной водой в течение 5-10 секунд. 2.4.2. На высушенные мазки, помещенные на мостик бактериологических чашек с влажным тампоном (для предотвращения высыхания сыворотки), наносят 1-2 капли рабочего разведения люминесцирующей поливалентной сальмонеллезной сыворотки. При необходимости определения групповой принадлежности сальмонелл применяют групповые люминесцирующие сальмонеллезные сыворотки. Мазки выдерживают во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре или 15 минут в термостате при 37 С. Затем мазки дважды по 10 минут промывают 0,15 М раст- вором хлористого натрия, ополаскивают дистиллированной водой и вновь высуши- вают. 2.4.3. Окрашенные мазки заключают в смесь, состоящую из 9 частей глицерина и 1 части 0,15 М раствора хлористого натрия, накрывают покровным стеклом, на которое наносят каплю -нефлюоресцирующего иммерсионного масла или диметилфта- лата, и просматривают под люминесцентным микроскопом. 2.4.4. Положительным результатом считается обнаружение сальмонелл, у ко- торых отмечается сияющая или яркая флюоресценция зеленого цвета периферии клеток с четко контрастируемой зоной по центру. В качестве контроля берут сальмонеллезную культуру, наносят ее на предмет- ное стекло и к ней добавляют люминесцирующую сыворотку. 2.5. Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки. 2.5. 1. 50 г корма помещают в колбу, содержащую 500 мл стерильного физиоло- гического раствора, встряхивают на шуттель-аппарате в течение 30 минут и из полу- ченной взвеси стерильными пипетками готовят разведения 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:1000000. По 1 мл каждого разведения вносят в пробирки (по выбору) со средами Эйкмана, Кесслера или Кода. Посевы помещают в термостат при темпе- ратуре 43 С для первых двух сред и при 37 С - для последней. Через 24 часа учитывают рост: на среде Эйкмана - по помутнению среды и образованию газа, на средах Кесслера и Кода - по изменению цвета сред. Титр кишечной палочки устанавливают по наибольшему разведению, в котором еще на- блюдался ее рост. Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев на плотные дифференциально-диагностические среды Эндо, Левина в бактериологических чаш- ках, разделенных на секторы для каждого разведения. Типичные колонии Е. coli характеризуются круглой формой, гладкой, выпук- лой или слегка приподнятой в центре поверхностью, ровными краями, розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском или без него на среде Эндо или черного цвета на среде Левина. 2.5.2. Выросшие изолированные колонии 5-формы (не менее 4) пересевают на МПБ, выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 16-24 часов. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды, заражения мышей; вторую - для при- готовления автоклавированного антигена, если кипяченый антиген не будет агглю- тинироваться поливалентными (комплексными) коли-сыворотками. У выделенных культур определяют морфологические и культурально-биохими- ческие свойства с целью проведения их родовой дифференциации, как указано в при- ложении 1. Морфологию бактерий изучают в мазках, окрашенных по Граму, подвижность определяют по характеру роста в 0,3%-ном полужидком МПА. 2.5.3. Для определения культурально-биохимических свойств бактерий исполь- зуют набор питательных сред, куда входят среды с углеводами и индикатором Анд- раде (лактоза, глюкоза, сахароза, маннит, дульцит, аденит, инозит), среда Кларка, нитратно-аммонийная среда, МПЖ, среда с мочевиной, МПБ или бульон Хоттингера и агар с глюкозой и сернокислым железом. 2.5.4. Патогенные свойства кишечной палочки определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. С этой целью внутрибрюшинно заражают трех мышей массой 14-16 г смывом с суточных агаровых культур, в дозе 500 млн. микробных тел. Концентрацию бактерий устанавливают по бактерийному стандарту. Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей в первые четверо суток после заражения. 2.5.5. Одновременно с определением морфологических, культурально-биохи- мических и патогенных свойств бактерий проводят серологическую типизацию культур кишечной палочки по 0-антигену с целью установления энзоотических типов. Для приготовления антигена каждую предназначенную для типизации суточ- ную агаровую культуру (пробирка со скошенным агаром) смывают стерильным фи- зиологическим раствором, доводят суспензию бактерий до концентрации 5-6 млрд/мл и кипятят в водяной бане в течение 1 часа. Уровень воды должен быть выше уровня культуры в пробирках. На чистое обезжиренное стекло наносят пастеровской пипеткой по капле каж- дой комплексной О-сыворотки, разведенной физиологическим раствором 1 : 5, и по капле исследуемого антигена. Затем хорошо перемешивают стеклянной палочкой или петлей. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 3 минут при покачивании стекла. В том случае когда антиген агглютинируется всеми комплексными сыворот- ками, его проверяют с физиологическим раствором для исключения самоагглютина- ции. Самоагглютинирующие антигены для серотипизации непригодны. Антигены, давшие четко выраженную агглютинацию на стекле с комплексной коли-сывороткой, исследуют в капельной реакции агглютинации (РА) с отдельными разведенными 1:10 типоспецифическими сыворотками, входящими в состав комплекс- ной сыворотки. 2.5.6. Если антиген из исследуемой культуры агглютинируется в капельной РА с одной или двумя-тремя моносыворотками, то его проверяют с этими же сыворот- ками в пробирочной РА, так как реакция на стекле имеет лишь ориентировочное значение. Для постановки пробирочной РА типоспецифические О-сыворотки, агглютини- рующие антиген из исследуемой культуры в РА на стекле, разводят физиологическим раствором, начиная с 1:100 до предельного титра сыворотки, указанного на эти- кетке, и во все пробирки добавляют по 2 капли антигена (концентрация 5-6 млрд. бактериальных тел по бактерийному стандарту), приготовленного из убитой нагре- ванием агаровой культуры обнаруженных бактерий. Одновременно ставят контроли: 1. Антиген + физиологический раствор (для исключения самоагглютинации) и 2. Сыворотка, разведенная 1:100, без антигена (дал исключения явления флоккуляции). Штатив с пробирками встряхивают и ставят в термостат при 37 С на 12-16 ча- сов, затем выдерживают при комнатной температуре 18-24 часа. Реакцию учиты- вают с помощью лупы или агглютиноскопа. Принадлежность к О-группе опреде- ляют по наивысшему разведению типоспецифической агглютинирующей сыворотки, вызывающей агглютинацию антигена исследуемой культуры, которое должно быта не ниже половины предельного титра типоспецифической сыворотки. Сыворотка и антиген в контроле не должны образовывать хлопьев. 2.5.7. Если все комплексные О-коли-сыворотки в капельной реакции не агглю- тинпруют антиген из убитой нагреванием культуры, то готовят из этого штамма суспензию бактерий и автоклавируют ее при давлении пара 1 атмосфера (120 С) ц течение 2 часов для разрушения термостабильного А-антигена. Автоклавирозан- ный антиген исследуют с сыворотками 08, 09, 0101, как указано в п. 2.5.5. 2.6. Исследования на анаэробы. 2.6.1. 50 г корма растирают в стерильной ступке с физиологическим растворам и засевают в несколько пробирок со средой Китта-Тароцци, молоком и по две чашки со средами Вильсона - Блера и кровяным агаром по Цейслеру. Для уничто- ження вегетативных форм по одной пробирке с жидкими средами прогревают при тем- пературе 80 С в течение 20 минут. Посевы помещают в термостат при температуре 37 С. Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной поглотитель кислорода. 2.6.2. Результаты посевов регистрируют в первый же день. Почернение среды Кильсона - Клера в течение 1-3 часов после посева, свертывание молока с обра- зованием ноздревато-губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6 часов, а также быстрое начало роста на среде Китта - Тароцци (через 4-5 часов) при обильном газообразовании является характерным для клостридиум перфрин- генс. Рост клостридиум ботулинум, наблюдаемый обычно на 2-З-й день, характери- зуется помутнением среды Китта - Тароцци, образованием осадка и запахом про- горк-того масла. При обнаружении роста на среде Китта - Тароцци производят микроскопиче- ское исследование и выделение чистой культуры посевом на 2-3 чашки с кровяным агаром по Цейслеру, которые выдерживают в анаэробных условиях при темпера- туре 37 С в течение 24-48 часов, после чего просматривают рост в чашках и отби- рают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам, указанным - в приложении 2. Биологическую пробу проводят на морских свинках или белых мышах путем внутрибрюшинного заражения бульонной культурой. При положительном резуль- тате подопытные животные гибнут через 12-48 часов. 2.6,3. Для идентификации отдельных возбудителей или типов одного вида ставят опыт нейтрализации токсина специфической сывороткой. Для этого мини- мальную смертельную дозу культуры в смеси с 0,2-0,5 мл соответствующей типа- специфической сыворотки выдерживают в термостате 45 минут и вводят мышам внутрибрюшинно. Для контроля испытуемую культуру или фильтрат вводят мышам без сыворотки. Вид и тип микроба определяют по выживаемости мышей, получивших соответствующую сыворотку. 2.6.4. При исследовании кормов на ботулизм (наличие токсинов) в качестве подопытных животных используют белых мышей. При этом могут быть применены два способа: а) нейтрализация токсина противоботулиновой сывороткой (антитоксином). Корм предварительно растирают в ступке со стерильным физиологическим раство- ром (1:4) и настаивают в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Настой центрифугируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К 0,5 мл фильтрата добавляют 0,2 мл поливалентной противоботулиновой сыворотки. Смесь выдержи- вают 1 час при комнатной температуре, затем одному животному вводят подкожно 0,5 мл фильтрата, другому - смесь фильтрата с сывороткой в той же дозе. Аналогичное исследование может быть проведено с 6-7-суточной культурой, выращенной на печеночном бульоне. В этом случае пастеровской пипеткой отсасы- вают верхний слой культуры, который фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Далее поступают, как указано выше; б) разрушение токсина кипячением фильтрата. Фильтрат готовят, как указано в подпункте "а" п. 2.6.4. Одну половину фильтрата кипятят в течение 30 минут. Затем одному животному внутрибрюшинно вводят 0,5-1,0 мл некипяченого фильт- рата, другому - в этой же дозе прокипяченного. 2.6.5. Положительным результатом биологической пробы по первому и вто- рому способам считают гибель мышей, наступившую как от фильтрата, не обработан- ного противоботулиновой сывороткой, так и от фильтрата, не подвергнутого кипя- чению. 3. Оценка кормов 3.1. Комбикорм используют сельскохозяйственным животным при отрицатель- ных результатах исследования на сальмонеллы, энтеропатогенные типы кишечной палочки и токсинообразующие анаэробы при условии его соответствия другим пока- зателям действующих стандартов. 3.2. Мясо-костную и рыбную муку используют сельскохозяйственным живот- ным при общей бактериальной обсеменености не более 500 тыс. микробных тел в 1 г и отрицательных результатах исследования на сальмонеллы, энтеропатогенные типы кишечной палочки и прется, а также токсинообразующне анаэробы при усло- вии соответствия другим показателям действующих стандартов. При обнаружении сальмонелл, энтеропатогенных типов кишечной на-точки и прется корм запрещается использовать животным без дополнительной обработки. Вторичную стерилизацию проводят в соответствии с технологическими режимами производства этих кормов или же этот корм подвергается проварке при температуре не ниже 100 С в течение 1 часа и дальнейшей обработке согласно установленному технологическому режиму приготовления кормов к скармливанию. 3.3. При установлении в кормах анаэробных микроорганизмов и их токсинов такие корма запрещается использовать животным без дополнительной термической (обработки, которую проводят при температуре 120-130 С в течение 2 часов. После- стерилизации корма подвергают бактериологическому исследованию с постановкой биопробы на наличие анаэробов и их токсинов и при получении отрицательных ре- зультатов они могут быть использованы на кормовые цели. При положительных результатах исследования эти корма уничтожают. 3.4. Корма, производство которых связано с тепловой обработкой, имеющие бактериальную обсеменен пасть свыше 500 тыс. микробных клеток в 1 г, при отсут- ствии патогенных микроорганизмов подлежат повторной стерилизации согласно технологическим инструкциям или могут быть направлены для производства грану- лированных кормов с термической обработкой, а также проварке, как указано в п. 3.2. настоящих правил. Рецепты основных питательных сред 1 С е л е н и т о в а я с р е д а Однозамещенный кислый селенистокислый натрий (без теллурита) NаНSеОз............................4,0 г Пептон (чешский, венгерский или ГДР)......................5,0 г Натрий фосфорнокислый двузамещенный (безводный) Nа2НРО4...7,0 г Натрий фосфорнокислый однозамещенный (безводный) NаН2РО4.................................................3,0 г Лактоза...................................................4,0 г Вода дистиллированная....................................1000мл К дистиллированной воде добавляют фосфаты, пептон и лактозу, растворяют их и стерилизуют при 112 С в течение 30 минут. Отдельно на стерильной дистилли- рованной воде готовят 10%-ный раствор кислого селенистокислого натрия, который добавляют к среде перед употреблением из расчета 0,4 мл на 10 мл среды. Готовая среда должна иметь рН 6,8-7,1. 2. М а г н и е в а я с р е д а а) Пентон.................................................4,2 г Хлористый натрий.......................................7,0 г КН2РО4.................................................1,5 г Дрожжевой экстракт....................................20,0 г Вода дистиллированная..................................890мл Растворяют при кипении, затем добавляют растворы "б" и "в" б) Хлористый магний кристаллический.......................36,0 г Вода дистиллированная..................................90,0 г в) 0,1%-ный водный раствор бриллиантового зеленого........5,0 мл Среду разливают в колбы и стерилизуют при 112 С 20 минут. 2. 1 . Д р о ж ж е в о й э к с т р а к т 1 кг прессованных пекарских дрожжей распределяют равномерно в 2 мл дистил- лированной воды, прогревают в автоклаве при 100 С 30 минут и оставляют отстаи- ваться в холодильнике при 4-5 С в течение 4-5 суток. Надосадочную жидкость разливают во флаконы по 50-100 мл. На каждые 100 мл экстракта добавляют 1,25 мл 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового, вновь прогревают при 100 С 30 минут в автоклаве. П р и м е ч а н и е. Экстракт можно готовить из сухих дрожжей, при этом на 1 кг сухих дрожжей необходимо брать 6 л дистиллированной воды. Готовый экстракт должен храниться в холодильнике.
3. Т р е x с а х а р н ы й а г а р с м о ч е в и н о й На 100 мл питательного агара (рН 7,2-7,4) берут: лактозы................................................1,0 г сахарозы...............................................1,0 г глюкозы................................................0,1 г мочевины...............................................1,О г соли Мора.............................................0,02 г гипосульфита натрия...................................0,63 г фенолового красного (фенолрота)...................0,4-0,6 мл Все ингредиенты, кроме фенолрота, растворяют в небольшом количестве дистил- лированной воды (10 мл) на водяной бане и вносят в расплавленный агар, фильтруют через марлю и доводят рН до 7,2-7,4. Затем добавляют фенолрот и разливают в про- бирки по 5-6 мл. Стерилизуют в прогретом автоклаве при 0,5 атмосферы 20 минут. 4.Среда КОДА Пептон................................................10,0 г Лактоза...............................................10,0 г Хлористый натрий.......................................5,0 г Алкилбензолсульфонат..................................12,0 г Бромкрезоловый пурпурный (1:100) (водно-спиртовой раствор 1:1)..........................................2,0 мл Метиленовый синий (1:1000)............................2,5 мл Вода дистиллированная................................1000 мл Компоненты, за исключением красителей, растворяют в 1000 мл дистиллирован- ной воды, доводят рН до 7,8-7,9 и кипятят 15-20 минут, после чего фильтруют через ватный фильтр и вносят растворы красителей. Разливают в пробирки и стери- лизуют при 0,5 атмосферы в течение 15-20 минут. 5. С р е д а К и т т а - Т а р о ц ц и Печень быка, теленка, лошади, кролика или морской свинки режут на кусочки по 1-3 г, смешивают их с тройным количеством обыкновенного нейтрального мясо- пептонного или хоттингеровского (1:8) бульона и кипятят 30 минут. Бульон фильт- руют, кусочки печени на сите промывают водой, подсушивают фильтровальной бу- магой или полотенцем. В пробирки помещают 3-4 г печени и 7-8 мл бульона, зали- вают 0,5 мл вазелинового масла и стерилизуют при 115 С в течение 30 минут. Печень можно заменить кусочками мяса. 6. К р о в я н о й а г а р п о Ц е й с л е р у К 3%-ному МПА добавляют 1% глюкозы, устанавливают рН 7,2 и разливают во флаконы по 100 мл, стерилизуют при 0,5 атмосферы в течение 30 минут. Перед употреблением к расплавленной и охлажденной до 45 С среде добавляют 20% све- жей дефибринированной крови. Среду разливают в чашки Петри. 7. С р е д а В и л ь с о н а - Б л е р а 100 мл 3%-ного МПА с 1% глюкозы расплавляют в водяной бане и добавляют 10 мл 20%-ного раствора сульфата натрия и 1 мл раствора хлорного железа. Оба раствора готовят на стерильной дистиллированной воде. Среду после изготовления не стерилизуют. Приложение I Основные дифференциальные признаки бактерий семейства ЕпtегоЬасtегiасеае ------------------------------------------------------------------------------ Биохимические Езсhе- CitгоЬас- Еп*егоЬас*ег 1 Рю1ец5 показатели richia ter (C.fre- Klebsi (E.coli) undii) ella ------------------------------------------------------------------------------ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ------------------------------------------------------------------------------ Подвижность +или- +реже- - + + + + + +реже- Сахароза + + + + + + + + - Лактоза +или- +или- + + + (+) - - - Глюкоза +или- +или- - + + + + - +или- + Маннит + + + + + + - - + Дульцит +или- +или- +или- - - - - - +или Адонит - - + +или- + - - - - Инозит - +или- + - + (+) - - +или- Индол +реже- -или+ - - - - + - - Сероводород -реже- + - - - - + + +реж- Реакция с метилротом + + - - - +или- + + + Реакция Фогес-Проскаэра - - + + + +или- - +или- - Усвоение нитратных и аммонийных солей - + + + + + +или- +или- + Разложение мочевины - -или(+)(+) - - - + + - Разложение желатины - - - (+) +или- + + + +или- Обозначения +положительный результат через 24-48 часов, -отрицательный резуль- тат, (+) положительная реакция выражена слабо. Приложение 2 Морфологические и культуральные свойства анаэробов Длина, Ширина, Подвиж- Капсуло- Спорооб- Поверхностные колонии Название микро- микро- ность образование разование на кровяном агаре метров метров Cl.septicum 2-10 0.8-1,1 + - Через 24-48 часов Вуалевые с бахромчатыми краями и нежными отростками, бесцветные, незначительный гемолиз Сl.оеdеmаtiеns 5-10 1,1-1,5 + - Через 48 часов Круглые, асбестовые или корне- видные, бесцветные или серые, Сl.hystoliticum 2-5 0,5-0,8 + - Через 24 часа Мелкие, круглые, гладкие,бес- цвет Сl.perfringens 4-8 1,0-1,5 - В организме Образуется только Округлые, выпуклые, продол- животного в средах, богатых говатые, сочные от серого до зеле- и на свер- белком ного цвета,окружены большом нутой сыво- зеленовато-коричневой зоной гемо- ротке лиза Сl.botulinum 4-9 0,5-1,2 + - Через 24-48 часов Круглые или неправильной формы, с отростками, исходящими из мотка переплетенных ниток, окружены зоной гемолиза ------------------------------------------------------------------------------------------------- Название Молоко Желатин Мозговая среда Свернутая сыворотка ------------------------------------------------------------------------------------------------- Cl.septicum Медленное свертывание Разжижение через Нет почернения Не Разжижается. Инво- (2-5 дней), запах кис- 3-5 дней люционные формы, споры лый Cl.oedematiens Медленное свертывание Разжижение через Нет почернения Не Разжижается. Инво- (4-10 дней) (3-5 дней) люционные формы, споры Cl.hystoliticum Свертывается через Разжижается быстро Почернение через Разжижается медленно одни сутки 3-6 дней Cl.perfringens Бурное свертывание Разжиженне на 3-5-й Нет почернения Не разжижается.Инво- (4-6 часов). Газообра- день люционные формы, споры зование бурное сыво- ротка прозрачная Сl.botulinum Пептонизируется Разжижается Чернеет медленно Разжижается слабо П р и м е ч а н и е. + положительный результат; - отрицательный результат.