МИНИСТЕРСТВО
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА                                       Утверждаю
  И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                             Заместитель  руководителя
 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                  Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)                                                В.В.Селиверстов

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

№ 13-7-2/1867 от 10.02.2000

   МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЮ
     АФЛАТОКСИНОВ В ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУРАХ, КОМБИКОРМАХ И ОРЕХАХ С
         ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ФАСТ АФЛАТОКСИН
           (производство фирмы АР-БИОФАРМ, Германия)

1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения суммы афлатоксинов В1, В2, G1 и
G2 в зерновых культурах, комбикормах и орехах и с помощью тест-системы для иммунно-
ферментного анализа РИДАСКРИН® ФАСТ Афлатоксин*

* RIDASCREEN® является зарегистрированной торговой маркой фирмы Ар-Биофарм, Германия

2. Краткое описание методики
Пробоподготовка:       Размол пробы, экстракция раствором метанола в воде, фильтрование

Затраты времени:
                Пробоподготовка                 около 15-ти минут
                Анализ                          около 15-ти минут
Предел обнаружения:                                   0.0017 мг/кг

3. Общие положения
Афлатоксинами называют группу высокотоксичных канцерогенных веществ, образующихся в
результате жизнедеятельности плесневых грибков Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus.
Так, например афлатоксин В1, а также афлатоксины В2, G1 и G2 часто могут быть
обнаружены в зерновых культурах, кукурузе, орехах и хлопковом семени.

До недавнего времени для контроля афлатоксинов применялся преимущественно метод
тонкослойной хроматографии и метод жидкостной хроматографии высокого давления.
Однако, хроматографические методы достаточно трудоемки, занимают длительное время,
сопровождаются сложной пробоподготовкой и значительным расходом реагентов. Кроме того, метод
жидкостной хроматографии высокого давления, а также, метод тонкослойной хроматографии в
количественном варианте, реализуются на дорогостоящем оборудовании и   нуждаются в
высокопрофессиональном обслуживании.
 

В последнее время, особенно в целях скрининга и в рутинной лабораторной практике широко
применяется более удобный метод иммунно-ферментного анализа (ELISA или ИФА).
Набор РИДАСКРИН® ФАСТ Афлатоксин представляет собой тест-систему для иммунно-
ферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, выпускается серийно и
предназначен для  количественного экспресс определения суммы афлатоксинов в зерновых
культурах, комбикормах и орехах.

4. Нормативные ссылки

Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность.
Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств
защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы,
пробирки. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические
условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные
параметры и размеры.

5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами.
Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован овечьими антителами,
специфичными к кроличьему иммуноглобулину IgG, в свою очередь, полученному путем
иммунизации кроликов афлатоксинами. Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые
(стандартные) образцы, препарат, содержащий антитела к афлатоксинам и препарат, содержащий
коныюгат афлатоксинов с ферментом дозируются в лунки активированного планшета. При инкубации
планшета в течение определенного времени молекулы афлатоксинов и молекулы коньюгата,
конкурируя между собой, связываются кроличьими антителами к афлатоксинау. В то же самое
время, при инкубации, происходит иммунно-сорбция кроличьих антител на поверхность лунок
планшета за счет их взаимодействия с овечьими антителами на поверхности.
На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы
коньюгата.

После промывки планшета в его лунки дозируется раствор, содержащий субстрат и хромоген.
В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором
ферментный фрагмент молекулы коньюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве
катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. После определенного времени развития
данной цветной реакции, в результате которой бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в
лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном фотометре при 450 нм, обратно
пропорциональна концентрации афлатоксинов в исследуемых образцах.

6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций.
6.1. Предел обнаружения афлатоксинов составляет:
     0.0017 мг/кг при навеске образца 5 г
6.2. Диапазон определяемых концентраций афлатоксинов составляет:
     0.0017 - 0.045 мг/кг при навеске образца 5 г
 

7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.
7.1. Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го        класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Меры массы по ГОСТ 7328
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Одноканальный дозатор на 50 мкл
8-канальный дозатор на 50 мкл
8-канальный дозатор на 250 мкл
Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 100 мл исп. 2 по ГОСТ 1770
Цилиндры градуированные 2-го класса точности вместимостью 50 мл и 100 мЛ
Пипетка градуированная 2-го класса точности вместимостью 1 мл по ГОСТ 29227

7.2. Вспомогательные устройства
Мельница для размола сыпучих продуктов
Колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 50 мл типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91
Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336
Фильтровальная бумага “красная лента”

7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа РИДАСКРИН® ФАСТ Афлатоксин*   в
стандартной комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8 лунок), сенсибили-   1 шт
зированный антителами к кроличьему IgG
Комплект стандартных растворов афлатоксинов** в водном растворе метанола   5Х1шт.
со следующими концентрациями: 0 ppb (нулевой стандарт), 1.7 мкг/л, 5 мкг/л,
15 мкг/л, 45 мкг/л по 1 мл
Антитела к афлатоксинам (черная крышка), 3 мл                              1 шт
Коньюгат афлатоксинов с пероксидазой (красная крышка), 3 мл                1 шт
Субстрат/хромоген, 6 мл (белая крышка)                                     1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты, 6 мл (желтая крышка)       1 шт
Метанол
Дистиллированная вода

Замечания по использованию и хранению тест- системы РИДАСКРИН® ФАСТ
Афлатоксин.

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности
определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим
номером партии.
Храните набор при температуре 2-8°С. HE ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет
вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.
Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых
солнечных лучей на флакон с раствором.
Признаки порчи реагентов:В случае окрашивания раствора хромогена не рекомендуется
использовать раствор, поскольку окрашивание раствора хромогена является признаком его
порчи.
 

В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым
стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком порчи реагентов.
 

*Поставляется 000 “СТАЙЛАБ” тел./факс (095) 265-44-05
**Указанные концентрации даны с учетом фактора разбавления (10) при пробоподготовке
образцов, то есть, результат определения афлатоксинов в исследуемой пробе может быть получен
непосредственно по калибровочной кривой.

8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности
при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по
ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также
требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные
устройства.

8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено
приточно-вытяжной вентиляцией.

Внимание! Стандартные растворы содержат токсичные афлатоксины. При работе
используйте перчатки, избегайте контакта реагентов с кожей.
Для мытья стеклянной посуды, загрязненной афлатоксинами, рекомендуется использовать
10% раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подстройте рН раствора
гипохлорита до 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на
ночь.

Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с
кожей.

9. Требования к квалификации исследований
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего
высшее или среднее специальное образование, владеющего техникой иммунно-ферментного
анализа и освоившего метод в процессе стажировки.

10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
Температура воздуха                                  20 ± 5 °С;
Атмосферное давление                      84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздуха                           не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети                                    220 ± 10 В;
Частота переменного тока                              50 ± 1 Гц

11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией
по отбору проб.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.

11.2. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.

11.3. Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1. Приготовление 70% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 70 мл метанола и доводят объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4 недели.

12. Пробоподготовка
12.1. Исследуемую пробу размалывают с помощью мельницы для размола сыпучих
 продуктов.

12.2. Взвесьте 5 г размолотой пробы в колбе с притертой пробкой, прилейте в колбу 25 мл
70% -го водного раствора метанола.

12.3. Тщательно встряхивайте колбу в течение трех минут

12.4. Профильтруйте раствор через фильтровальную бумагу типа “красная лента”

12.5. Смешайте в пробирке 1 мл фильтрата и 1 мл дистиллированной воды

12.6. Для анализа используют 50 мкл раствора.

13. Порядок проведения измерений.

13.1. Предварительные замечания по проведению измерений с помощью тест-системы
РИДАСКРИН® ФАСТ Афлатоксин.

Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов до комнатной
(30 - 40 минут до температуры 18 - 20°С).

Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 - 8°С.

В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета.

Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа существенно зависит от
тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной
далее процедуре отмывки планшета.

На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.

13.2. Подготовка к измерениям
13.2.1. Микротитровальный планшет
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов.

Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с
силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8
°С.

13.2.2. Стандартные растворы.
Стандартные растворы афлатоксина поставляются готовыми для использования. Величина
концентрации афлатоксина, нанесенная на флаконы с растворами дана с учетом фактора
разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке, поэтому результат определения может
быть получен непосредственно по калибровочной кривой.

13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех
запланированных определений в дублях (по 2 раза). Запишите координаты лунок, предназначенных
для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи
приведен на Рис. 1.
 
c1 С1 П3 П3 П11 П11 П19 П19 П27 П27 П35 П35
С2 С2 П4 П4 П12 П12 П20 П20 П28 П28 П36 П36
СЗ СЗ П5 П5 П13 П13 П21 П21 П29 П29 П37 П37
С4 С4 П6 П6 П14 П14 П22 П22 ПЗО ПЗО П38 П38
С5 С5 П7 П7 П15 П15 П23 П23 П31 П31 ПЗ9 П39
С6 С6 П8 П8 П16 П16 П24 П24 П32 П32 П49 П49
П1 П1 П9 П9 П17 П17 П25 П25 ПЗЗ ПЗЗ П41 П41
П2 П2 П10 П10 П18 П18 П26 П26 П34 П34 П42 П42

Рисунок 1.     Пример формы записи координат лунок перед выполнением анализа
                          (С-стандарты, П-пробы).
13.3.2. Добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары
лунок.

13.3.3. Добавьте по 50 мкл препарата коньюгата в каждую лунку.

13.3.4. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител. Тщательно перемешайте и
оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение 10 мин (± 1 мин).

13.3.5. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу,
накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и снова
опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки
лунок еще два раза.

13.3.6. Добавьте по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена/субстрата в каждую лунку.
Тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут (± 0.5 мин) в
темноте.

13.3.7. Добавьте в каждую лунку по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента и хорошо перемешайте. В
течение 10-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке
при 450 нм

14. Обработка результатов исследования
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и
исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках
с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения
оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым
стандартом, то есть:

Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
----------------------------------   X 100 = % поглощения
Средняя оптическая плотность лунки
с нулевым стандартом

По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и
соответствующим значениям концентрации афлатоксина в мкг/кг (ppb) строится калибровочная
кривая в полулогарифмической системе координат (см. Рис. 2).

Оптическая плотность,
      (%)

                     Концентрация, мкг/кг
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы РИДАСКРИН® ФАСТ Афлатоксин
Концентрация афлатоксинов в исследуемых растворах в мкг/кг (ppb) считывается по
калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному
для этих растворов.

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать
специализированное программное обеспечение, например, РИДА* Софт*. При компьютерной
обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного
обеспечения.

*Поставляется ООО “СТАЙЛАБ” тел./факс (095) 265-44-05

РАЗРАБОТАНО:
Представитель R-Biopharm в России и                      Начальник отдела лабораторной
странах СНГ                                              диагностики Департамента
Директор ООО "СТАЙЛАБ ”                                  ветеринарии Минсельхозпрода России
A.B. Галкин                                              В.И. Белоусов

Методика апробирована в Центральной научно-методической ветеринарной
лаборатории Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России (ЦНМВЛ)

Директор ЦНМВЛ                                         Заведующая отделом ИФА
В.А. Седов                                             О.Н. Виткова