МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
Утверждаю
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
Заместитель руководителя
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)
В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
№ 13-7-2/1867 от 10.02.2000
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ
ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЮ
АФЛАТОКСИНОВ В ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУРАХ,
КОМБИКОРМАХ И ОРЕХАХ С
ПОМОЩЬЮ
ТЕСТ-СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ФАСТ АФЛАТОКСИН
(производство фирмы АР-БИОФАРМ, Германия)
1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения
суммы афлатоксинов В1, В2, G1 и
G2 в зерновых культурах, комбикормах и орехах и с помощью
тест-системы для иммунно-
ферментного анализа РИДАСКРИН® ФАСТ Афлатоксин*
* RIDASCREEN® является зарегистрированной торговой маркой фирмы Ар-Биофарм, Германия
2. Краткое описание методики
Пробоподготовка:
Размол пробы, экстракция раствором метанола в воде, фильтрование
Затраты времени:
Пробоподготовка
около 15-ти минут
Анализ
около 15-ти минут
Предел обнаружения:
0.0017 мг/кг
3. Общие положения
Афлатоксинами называют группу высокотоксичных канцерогенных
веществ, образующихся в
результате жизнедеятельности плесневых грибков Aspergillus
flavus и Aspergillus parasiticus.
Так, например афлатоксин В1, а также афлатоксины В2,
G1 и G2 часто могут быть
обнаружены в зерновых культурах, кукурузе, орехах и хлопковом
семени.
До недавнего времени для контроля афлатоксинов применялся
преимущественно метод
тонкослойной хроматографии и метод жидкостной хроматографии
высокого давления.
Однако, хроматографические методы достаточно трудоемки,
занимают длительное время,
сопровождаются сложной пробоподготовкой и значительным
расходом реагентов. Кроме того, метод
жидкостной хроматографии высокого давления, а также,
метод тонкослойной хроматографии в
количественном варианте, реализуются на дорогостоящем
оборудовании и нуждаются в
высокопрофессиональном обслуживании.
В последнее время, особенно в целях скрининга и в рутинной
лабораторной практике широко
применяется более удобный метод иммунно-ферментного анализа
(ELISA или ИФА).
Набор РИДАСКРИН® ФАСТ Афлатоксин представляет собой тест-систему
для иммунно-
ферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами,
выпускается серийно и
предназначен для количественного экспресс определения
суммы афлатоксинов в зерновых
культурах, комбикормах и орехах.
4. Нормативные ссылки
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация
и общие правила безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая
искробезопасность.
Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования
и номенклатура средств
защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная.
Цилиндры, мензурки, колбы,
пробирки. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые.
Технические условия.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и
образцовые. Общие технические
условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные.
Типы, основные
параметры и размеры.
5. Сущность метода.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов
с антителами.
Поставляемый в комплекте набора планшет сенсибилизирован
овечьими антителами,
специфичными к кроличьему иммуноглобулину IgG, в свою
очередь, полученному путем
иммунизации кроликов афлатоксинами. Анализ выполняется
следующим образом. Исследуемые
(стандартные) образцы, препарат, содержащий антитела
к афлатоксинам и препарат, содержащий
коныюгат афлатоксинов с ферментом дозируются в лунки
активированного планшета. При инкубации
планшета в течение определенного времени молекулы афлатоксинов
и молекулы коньюгата,
конкурируя между собой, связываются кроличьими антителами
к афлатоксинау. В то же самое
время, при инкубации, происходит иммунно-сорбция кроличьих
антител на поверхность лунок
планшета за счет их взаимодействия с овечьими антителами
на поверхности.
На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются
свободные молекулы
коньюгата.
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор,
содержащий субстрат и хромоген.
В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата
с хромогеном, в котором
ферментный фрагмент молекулы коньюгата, связанной на
поверхности лунки, выступает в качестве
катализатора, образуются окрашенные продукты реакции.
После определенного времени развития
данной цветной реакции, в результате которой бесцветный
хромоген окрашивается в голубой цвет, в
лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет
раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на планшетном
фотометре при 450 нм, обратно
пропорциональна концентрации афлатоксинов в исследуемых
образцах.
6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций.
6.1. Предел обнаружения афлатоксинов составляет:
0.0017 мг/кг при навеске образца
5 г
6.2. Диапазон определяемых концентраций афлатоксинов
составляет:
0.0017 - 0.045 мг/кг при навеске
образца 5 г
7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы
и материалы.
7.1. Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го
класса точности с наибольшим пределом
взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Меры массы по ГОСТ 7328
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Одноканальный дозатор на 50 мкл
8-канальный дозатор на 50 мкл
8-канальный дозатор на 250 мкл
Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 100 мл
исп. 2 по ГОСТ 1770
Цилиндры градуированные 2-го класса точности вместимостью
50 мл и 100 мЛ
Пипетка градуированная 2-го класса точности вместимостью
1 мл по ГОСТ 29227
7.2. Вспомогательные устройства
Мельница для размола сыпучих продуктов
Колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 50
мл типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91
Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336
Фильтровальная бумага “красная лента”
7.3. Реактивы и материалы
Тест-система для иммунно-ферментного анализа РИДАСКРИН®
ФАСТ Афлатоксин* в
стандартной комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8
лунок), сенсибили- 1 шт
зированный антителами к кроличьему IgG
Комплект стандартных растворов афлатоксинов** в водном
растворе метанола 5Х1шт.
со следующими концентрациями: 0 ppb (нулевой стандарт),
1.7 мкг/л, 5 мкг/л,
15 мкг/л, 45 мкг/л по 1 мл
Антитела к афлатоксинам (черная крышка), 3 мл
1 шт
Коньюгат афлатоксинов с пероксидазой (красная крышка),
3 мл
1 шт
Субстрат/хромоген, 6 мл (белая крышка)
1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты, 6 мл
(желтая крышка) 1 шт
Метанол
Дистиллированная вода
Замечания по использованию и хранению тест- системы РИДАСКРИН®
ФАСТ
Афлатоксин.
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере
чувствительности
определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами
из другого набора с другим
номером партии.
Храните набор при температуре 2-8°С. HE ЗАМОРАЖИВАЙТЕ
НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте
их в фольгированный пакет
вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.
Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте
попадания прямых
солнечных лучей на флакон с раствором.
Признаки порчи реагентов:В случае окрашивания раствора
хромогена не рекомендуется
использовать раствор, поскольку окрашивание раствора
хромогена является признаком его
порчи.
В случае, если величина оптической плотности, измеренной
в лунке с нулевым
стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком
порчи реагентов.
*Поставляется 000 “СТАЙЛАБ” тел./факс (095) 265-44-05
**Указанные концентрации даны с учетом фактора разбавления
(10) при пробоподготовке
образцов, то есть, результат определения афлатоксинов
в исследуемой пробе может быть получен
непосредственно по калибровочной кривой.
8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования
техники безопасности
при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007,
требования пожарной безопасности по
ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками
по ГОСТ 12.1.019, а также
требования, указанные в технической документации на весы,
спектрофотометр и вспомогательные
устройства.
8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений,
должно быть снабжено
приточно-вытяжной вентиляцией.
Внимание! Стандартные растворы содержат токсичные афлатоксины.
При работе
используйте перчатки, избегайте контакта реагентов с
кожей.
Для мытья стеклянной посуды, загрязненной афлатоксинами,
рекомендуется использовать
10% раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной
кислоты подстройте рН раствора
гипохлорита до 7, залейте раствором загрязненную посуду
и оставьте в контакте с раствором на
ночь.
Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту.
Избегайте контакта стоп-реагента с
кожей.
9. Требования к квалификации исследований
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают
специалиста, имеющего
высшее или среднее специальное образование, владеющего
техникой иммунно-ферментного
анализа и освоившего метод в процессе стажировки.
10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены
следующие условия:
Температура воздуха
20 ± 5 °С;
Атмосферное давление
84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздуха
не более 80% при температуре 25°С;
Напряжение в сети
220 ± 10 В;
Частота переменного тока
50 ± 1 Гц
11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей
нормативной документацией
по отбору проб.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.
11.2. Пробы, предназначенные для анализа, должны хранится в холодном темном месте.
11.3. Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1. Приготовление 70% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 70 мл метанола и доводят
объем раствора до метки
дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре - 4
недели.
12. Пробоподготовка
12.1. Исследуемую пробу размалывают с помощью мельницы
для размола сыпучих
продуктов.
12.2. Взвесьте 5 г размолотой пробы в колбе с притертой
пробкой, прилейте в колбу 25 мл
70% -го водного раствора метанола.
12.3. Тщательно встряхивайте колбу в течение трех минут
12.4. Профильтруйте раствор через фильтровальную бумагу типа “красная лента”
12.5. Смешайте в пробирке 1 мл фильтрата и 1 мл дистиллированной воды
12.6. Для анализа используют 50 мкл раствора.
13. Порядок проведения измерений.
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений
с помощью тест-системы
РИДАСКРИН® ФАСТ Афлатоксин.
Перед использованием тест-системы доведите температуру
всех реагентов до комнатной
(30 - 40 минут до температуры 18 - 20°С).
Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 - 8°С.
В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета.
Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа
существенно зависит от
тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно
следуйте описанной
далее процедуре отмывки планшета.
На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.
13.2. Подготовка к измерениям
13.2.1. Микротитровальный планшет
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь
необходимое количество стрипов.
Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный
пакет вместе с
силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить
на хранение при температуре 2 - 8
°С.
13.2.2. Стандартные растворы.
Стандартные растворы афлатоксина поставляются готовыми
для использования. Величина
концентрации афлатоксина, нанесенная на флаконы с растворами
дана с учетом фактора
разбавления исследуемых образцов при пробоподготовке,
поэтому результат определения может
быть получен непосредственно по калибровочной кривой.
13.3. Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве,
необходимом для выполнения всех
запланированных определений в дублях (по 2 раза). Запишите
координаты лунок, предназначенных
для стандартных растворов и подготовленных исследуемых
растворов. Пример формы записи
приведен на Рис. 1.
| c1 | С1 | П3 | П3 | П11 | П11 | П19 | П19 | П27 | П27 | П35 | П35 |
| С2 | С2 | П4 | П4 | П12 | П12 | П20 | П20 | П28 | П28 | П36 | П36 |
| СЗ | СЗ | П5 | П5 | П13 | П13 | П21 | П21 | П29 | П29 | П37 | П37 |
| С4 | С4 | П6 | П6 | П14 | П14 | П22 | П22 | ПЗО | ПЗО | П38 | П38 |
| С5 | С5 | П7 | П7 | П15 | П15 | П23 | П23 | П31 | П31 | ПЗ9 | П39 |
| С6 | С6 | П8 | П8 | П16 | П16 | П24 | П24 | П32 | П32 | П49 | П49 |
| П1 | П1 | П9 | П9 | П17 | П17 | П25 | П25 | ПЗЗ | ПЗЗ | П41 | П41 |
| П2 | П2 | П10 | П10 | П18 | П18 | П26 | П26 | П34 | П34 | П42 | П42 |
Рисунок 1. Пример формы записи
координат лунок перед выполнением анализа
(С-стандарты, П-пробы).
13.3.2. Добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых
растворов в соответствующие пары
лунок.
13.3.3. Добавьте по 50 мкл препарата коньюгата в каждую лунку.
13.3.4. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител.
Тщательно перемешайте и
оставьте на инкубацию при комнатной температуре в течение
10 мин (± 1 мин).
13.3.5. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета
и тщательно выбейте
капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного
постукивания рамки с лунками по столу,
накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки 250
мкл дистиллированной воды и снова
опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано
выше. Повторите процедуру промывки
лунок еще два раза.
13.3.6. Добавьте по 2 капли (100 мкл) раствора хромогена/субстрата
в каждую лунку.
Тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре
в течение 5 минут (± 0.5 мин) в
темноте.
13.3.7. Добавьте в каждую лунку по 2 капли (100 мкл) стоп-реагента
и хорошо перемешайте. В
течение 10-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте
оптическую плотность в каждой лунке
при 450 нм
14. Обработка результатов исследования
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках
со стандартными и
исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической
плотности, измеренной в лунках
с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на
100. Таким образом, результат измерения
оптической плотности выражается в процентах от оптической
плотности лунки с нулевым
стандартом, то есть:
Средняя оптическая плотность лунки
со стандартом (пробой)
---------------------------------- X 100
= % поглощения
Средняя оптическая плотность лунки
с нулевым стандартом
По величинам относительного поглощения, вычисленным для
стандартных растворов и
соответствующим значениям концентрации афлатоксина в
мкг/кг (ppb) строится калибровочная
кривая в полулогарифмической системе координат (см. Рис.
2).
Оптическая плотность,
(%)
Концентрация, мкг/кг
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы
РИДАСКРИН® ФАСТ Афлатоксин
Концентрация афлатоксинов в исследуемых растворах в мкг/кг
(ppb) считывается по
калибровочной кривой соответственно относительному поглощению,
измеренному и вычисленному
для этих растворов.
Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется
использовать
специализированное программное обеспечение, например,
РИДА* Софт*. При компьютерной
обработке результатов следует руководствоваться инструкцией
по использованию программного
обеспечения.
*Поставляется ООО “СТАЙЛАБ” тел./факс (095) 265-44-05
РАЗРАБОТАНО:
Представитель R-Biopharm в России и
Начальник отдела лабораторной
странах СНГ
диагностики Департамента
Директор ООО "СТАЙЛАБ ”
ветеринарии Минсельхозпрода России
A.B. Галкин
В.И. Белоусов
Методика апробирована в Центральной научно-методической
ветеринарной
лаборатории Департамента ветеринарии Минсельхозпрода
России (ЦНМВЛ)
Директор ЦНМВЛ
Заведующая отделом ИФА
В.А. Седов
О.Н. Виткова