МИНИСТЕРСТВО                            
  СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА                            Утверждаю                  
   И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ                         Заместитель начальника
 РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ                       Департамента ветеринарии
(Минсельхозпрод России)                     В.В. селиверстов

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

19.03.96 г. № 13-7-2/555

       
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ 
по лабораторной диагностике 
трихомоноза крупного 
рогатого скота.

1. Общие положения.
1.1. Трихомоноз  -  протозойная  болезнь крупного рогатого скота, 
вызываемая Trichomonas foetus,  характеризуется поражением и  
функциональным  расстройством половой сферы.  Течение болезни 
преимущественно хроническое, но у коров и нетелей бывает острое.

1.2. Диагноз на трихомоноз устанавливают на основании 
результатов микроскопического, культурального исследований 
с учетом клинических и эпизоотологических данных.

1.3. Лабораторные исследования на трихомоноз включают:
микроскопию  нативного  материала;
посев материала на питательную среду;
дифференциацию возбудителей.

2. Отбор и пересылка материала для исследования.
2.1. Для исследования в лабораторию направляют: слизь из влагалища 
или шейки матки от подозреваемого в заболевании животного;  соскобы
со слизистой оболочки препуциального мешка, секрет придаточных 
половых желез,  сперму быка, выделения из половых органов; аборти-
рованный плод целиком  или сычуг с содержимым,  паренхиматозные 
органы плода и часть плаценты.

2.2. Перед отбором материала для исследования моют наружные половые 
губы у коров,  область препуциального отверстия у быков тёплой водой и         
вытирают чистым полотенцем.

2.3. Вагинально-цервикальную слизь берут в период течки.  За день до 
отбора материала рекомендуется вводить животным подкожно 1.5-2.0 куб.см 0.5%-
ного водного раствора прозерина или 1%-ного раствора карбохолина.

2.4. При отборе материала и  его  разведении  используют  водный 
раствор хлорида  натрия массовой концентрацией 8.5 г/куб.дм,  рН 7.0-7.2 
(далее раствор хлорида натрия).

2.5. Вагинально-цервикальную слизь берут полистироловыми пипетками.  
Для этого к шприцу при помощи резиновой муфты присоединяют полистироловую 
пипетку, набирают 5 куб.см раствора хлорида натрия и через раскрытое зеркалом 
влагалище вводят его под давлением в  шейку  матки на глубину 3-4 см.
Затем, не извлекая пипетки,  шприцем  насасывают раствор  хлорида 
натрия со слизью,  переносят в стерильную пробирку,  которую закрывают 
резиновой пробкой.

Вагинальную слизь можно брать ложкой-катетером, которую вводят во 
влагалище животного без зеркала.  При этом положение ложки должно быть 
боковым,  а ее стержня - горизонтальным. Ложкой делают соскобы из различных 
мест слизистой оболочки влагалища и через канал стержня переливают в пробирку.  
Если соскоб густой консистенции, через канал стержня вводят 5 куб.см раствора 
хлорида натрия, затем насасывают, выливают в пробирку и закрывают пробкой.

2.6. От быков станций (предприятий) по искусственному  осеменению 
животных  берут сперму и препуциальную слизь;  от быков,  используемых для 
естественного спаривания, - препуциальную слизь и секрет придаточных половых 
желез.

Сперму у быков получают при помощи искусственной вагины и переливают в 
стерильные флаконы и пробирки.

Секрет придаточных половых желез у быков получают путем их массажа 
через прямую кишку в стерильные пробирки или флаконы.

Слизь из различных мест слизистой оболочки препуция берут  с  помощью  
прибора ПСБ-1.  Смонтированный прибор вводят в полость препуция до ее 
середины. Затем выдвинутым стержнем с наконечником и впитывающим тампоном  
делают 3-4 возвратно-поступательных движения от свода препуциальной полости до 
трубки прибора. Стержень втягивают в трубку, осторожно  извлекают, опускают в 
пробирку с 3 куб.см раствора хлорида натрия, тампон отжимают и извлекают, 
пробирку закрывают резиновой пробкой.

2.7. Материал для исследования отбирают не раньше, чем через 6 дней 
после профилактических орошении и через 10 дней после лечения 
трихомонадоцидными препаратами.

2.8. Пробы  секрета  придаточных  половых  желез,  неразбавленной 
спермы,  препуциальной,  влагалищной слизи, патологических выделений в 
пробирках или флаконах помещают в термос со льдом и нарочным доставляют в 
лабораторию не позднее 4 ч. после отбора.

2.9. Абортированный плод целиком или сычуг с содержимым, 
паренхиматозные органы плода,  часть плаценты во влагонепроницаемой таре 
доставляют в лабораторию не позднее 12 ч. после аборта.  В холодное  время 
года плоды рекомендуется замораживать.

3. Микроскопическое исследование
3.1. С  измененных участков плаценты делают соскобы и опускают во 
флаконы.

Соскобы густой  консистенции разбавляют раствором хлорида натрия 
температуры 37°C в 2-5 раз.

3.2. Из  доставленного для исследования патологического материала 
делают по 2 препарата из каждого объекта.  Жидкий  материал  (соскобы, слизь 
препуциальная,  влагалищная,  секрет,  патологические выделения) берут 
пастеровской пипеткой со дна флакона или пробирки, каплю наносят на  чистое  
предметное стекло и накрывают покровным.  Готовый препарат, исследуют методом 
раздавленной капли  под  малым  (х8-10),  затем  под средним увеличением 
микроскопа (х40) в затемненном поле зрения.

3.3. В положительных случаях в препаратах обнаруживают живых три-
хомонад  с ундулирующей мембраной и аксостилем,  движения их скачкообразно-
поступательное  или  поступательно-вращательное.  Дифференциацию трихомонад 
проводят как указано в п.5.1.

4. Культуральное исследование
4.1. При Отсутствии трихомонад в исходных мазках проводят культу-
ральные исследования,  используя среду Петровского или пептонно-агаровую 
(приложение).

4.2. Каждую пробу  (сперму,  секрет,  препуциальную,  влагалищную 
слизь,  патологические выделения) от животного высевают в две пробирки со 
средой.  При исследовании абортированного плода пастеровской пипеткой делают 
посевы из смеси содержимого грудной,  брюшной полостей, сычуга,  из печени,  
легких, сердца, соскобов с измененных участков плаценты,  околоплодной 
жидкости в две пробирки со средой.  В пробирки со средой вносят по 0,3-0,5 
куб.см материала. 

4.3. Засеянные пробирки инкубируют в термостате при 37+-1 гр.С в те-
чение 10 дн.

Посевы просматривают визуально на 3,  5, 7, 9 дн. При обнаружении 
помутнения среды стерильной пипеткой берут каплю среды со дна пробирки и  
готовят  препарат.  Если в препарате обнаруживают живых трихомонад, 
исследование прекращают.                                     <


5. Дифференциальная диагностика и оценка результатов.
5.1. Для дифференциации из материала или среды, содержащих трихомонад,  
готовят по 2 мазка. Материал берут стерильной пастеровской пипеткой со дна 
пробирки,  наносят на  чистое  обезжиренное  предметное стекло и распределяют 
тонким слоем.  Мазки высушивают на воздухе, фиксируют этиловым ректификованным 
спиртом 96-градусным в течение  20-25  мин, окрашивают азур-эозином по 
Романовскому-Гимзе (краску разводят дистиллированной водой рН 7,0-7,2 в 
соотношении 1:10) - 40-90 мин. (в зависимости  от  качества краски и 
температуры),  промывают дистиллированной или водопроводной водой рН 7,0-7,2 до 
исчезновения  следов  краски  на фильтровальной бумаге,  высушивают и исследуют 
под иммерсионной системой микроскопа (х90).

5.2. При микроскопии обнаруживают трихомонад округлой,  овальной, 
грушевидной,  ланцетовидной, палочковидной форм. Цитоплазма трихомонад 
окрашивается  в  голубой цвет различной интенсивности,  ядро - в красно-
фиолетовый или красный, жгутики - в красный или розовый цвет.

От переднего  конца  Т.foetus  отходят 4 жгутика,  из которых три 
направлены вперед,  а четвертый,  окаймляя ундулирующую мембрану, идет назад и 
оканчивается свободно.  Вдоль всего тела расположен аксостиль. Ядро овальной 
формы, чаще расположено ближе к передней части тела возбудителя.

5.3. Трихомонад необходимо дифференцировать от других  жгутиковых 
простейших.  Дифференциация основана на наличии характерных морфологических 
признаков возбудителей. У непатогенных жгутиковых родов Oicomonas,  Cercomonas, 
Bodo ундулирующая мембрана и аксостиль отсутствуют и имеются 1 или 2 жгутика.

5.4. Результат исследований считают положительным при обнаружении в 
препарате из нативного материала или посевов возбудителя  трихомоноза.

6. Сроки исследований:
микроскопического - 1 дн,
культурального    - 10 дн.

С утверждением настоящих Методических указаний на территории Российской 
Федерации утрачивает силу "Методические указания по лабораторной диагностике 
трихомоноза крупного рогатого скота", одобренные Главветупром МСХ СССР 29.12.85 г.


                                                             Приложение          
                                           к "Методическим указаниям по  
                                               лабораторной диагностике 
                                   трихомоноза крупного рогатого скота"

                 Рецепты, питательных сред

1. Среда Петровского. Свежую печень крупного рогатого скота освобождают 
от жира, пленок, канальцев и измельчают в мясорубке. 1 кг фарша 
заливают 1 куб.дм водопроводной воды рН 7,0-7,2,  настаивают в 
течение 1 ч. и кипятят при помешивании 1 ч.  После отстаивания фарш 
удаляют,  а жидкость доливают дистиллированной водой рН 7,6-7,2 до 
первоначального объема и фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

Берут 500 куб. см  печеночной  воды и 500 куб.см дистиллированной воды 
рН 7,0-7,2  добавляют 10 г пептона,  5- г хлорида натрия (химически чистого) и 
доводят до кипения.  Бульон охлаждают,  определяют рН и  доводят 1%-ным водным 
раствором едкого натра до 8,2-8,4.  Бульон повторно кипятят в течение 30 мин. 
Затем добавляют 10 г мальтозы или глюкозы, 0,3 г растворимого крахмала. Среду 
разливают в стерильные пробирки по 8 куб.см, заливают вазелиновым маслом по 
0,3-0,5 куб.см,  стерилизуют при 112+-1гр.С в течение 30 мин.

Полученная среда светло-коричневого или светло-соломенного цвета, рН 
готовой среды 7,2-7,4.

Срок хранения среды в холодильнике до 6 мес.

2. Пептонно-агаровая среда.  К 900 куб.см кипяченой дистиллированной 
воды  рН 7,0-7,2 добавляют 0,5 г агар-агара и смесь кипятят до 
полного растворения компонента.  В горячий раствор последовательно 
вносят 20 г пептона,  10 г. глюкозы, 7 г хлорида натрия (химически 
чистого.), постоянно встряхивая колбу.  После растворения 
компонентов среду в  горячем виде фильтруют через слой 
фильтровальной бумаги,  в фильтрат добавляют кипяченную 
дистиллированную воду до первоначального объема,  закрывают 
резиновой пробкой с инъекционной иглой, а горлышко с пробкой 
перевязывают двумя слоями марли и ставят в кипящую  баню  на  1  ч,  
рН  среды 6,9-7,2.  Если рН среды ниже, добавляют по каплям 1 %-ный 
водный раствор едкого натра.

Охлажденную среду разливают в стерильные пробирки по 8 куб.см,  нас-
лаивают вазелиновое или растительное масло по 0,5 куб.см,  закрывают ватными 
пробками и стерилизуют при 112+-1°С в течение 30 мин.  Среда светло-соломенного 
цвета, содержит небольшую взвесь из частиц агар-агара.

Срок хранения среды в холодильнике до 3 мес.

Перед посевом  в  каждую пробирку со средами добавляют стерильную 
сыворотку крови лошади или крупного рогатого скота без признаков гемолиза  - 1 
куб.см и антибиотики из расчета на 1 см  среды:  стрептомицин -1 мг, пенициллин 
- 1000 ед., а в пептонно-агаровую среду дополнительно нистатит - 250 ед. После 
чего пробирки помещают в термостат при 37+-1 гр.С на 1-1.5 ч.