Продолжение
Рецепты приготовления реактивов, питательных сред и методы
определения ферментативных свойств культур бактерий
1. Глицериновый раствор для консервирования фекалий
Состав: Глицерин нейтральный - 300 куб.см
Натрий хлористый - 5 г
Вода дистиллированная - 700 куб.см
Раствор стерилизуют при 1 атм (121 °С) в течение 20 мин или прогревают в водяной
бане (100 °С) в течение 30-40 мин.
2. Среда с мочевиной (по Преусу)
Состав: Бульон Хоттингера или мартеновский бульон - 1000 куб.см
Агар-агар - 15 г
Глюкоза - 5 г
50% водный раствор мочевины - 20 куб.см
0,2% раствор бромтимолблау - 12 куб.см
Приготовление: к стерильному расплавленному агару на бульоне Хоттингера или
мартеновском бульоне с рН 6,9-7,0 добавляют глюкозу, растворы мочевины и
индикатора бромтимолблау. Расплавленную среду разливают в стерильные
пробирки по 5 куб.см и стерилизуют однократно текучим паром 20 мин. Перед
употреблением среду скашивают. Готовая среда имеет зеленовато-оливковый цвет.
При расщеплении мочевины среда приобретает синий цвет, при отсутствии
расщепления мочевины она окрашивается в желтый цвет.
3. Цитратный агар Симонса
Для определения способности бактерий усваивать цитратно-аммонийные соли
используют коммерческую сухую среду, которую готовят согласно указаниям на
этикетке препарата, или агар Симонса, приготовленный на основе жидкой среды Козера.
Состав среды Козера:
Натрий-аммоний фосфорнокислый - 1,5 г
двузамещенный (NaNH4 HPО4 х 4Н2О)
Калий фосфорнокислый - 1 г
однозамещенный (КН2РО4)
Магний сернокислый (MgSО4 х РНзО) - 0,2 г
Натрий лимоннокислый (Na3C6H5О7 х 5Н2О) - 3 г
Дистиллированная вода - 1000 куб.см
Для приготовления агара Симонса к 1 куб.дм среды Козера добавляют 20 г агар-агара и
10 куб.см индикатора бромтимолблау. Последний готовят из расчета: бромтимолблау 1 г;
0,1 N раствор NaOH - 25 куб.см (для получения указанного раствора к 100 куб.см
дистиллированной воды добавляют 0,4 г NaOH), дистиллированная вода — 475 куб.см .
Среду нагревают до полого расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый
фильтр, затем разливают в пробирки по 5 см и стерилизуют при 0,5 атм. в течение 15
мин. Готовая среда имеет зеленовато-оливковый цвет. Перед употреблением среду
скашивают.
Бактерии, способные усваивать цитратно-аммонийные соли, дают рост на агаре
Симонса с изменением его в синий цвет. При отсутствии указанного свойства роста
культуры не происходит и цвет среды не изменяется.
4.Среда для определения сероводорода
К 1 куб.дм расплавленного стерильного 1,7%-ного МПА добавляют 0,2 г
сернокислого железа (FeSО4x7Н2О), 0,3 г серноватистокислого натрия-тиосульфата
(Nа2S2O3 х 5Н2О), 1 г лактозы, 12 куб.см 0,2% водного раствора фенолрота. После
размешивания компонентов среду разливают в стерильные пробирки по 6-7 куб.см и
стерилизуют текучим паром в течение 20 мин. Готовая среда имеет бордово-красный
цвет. Перед употреблением среду скашивают так, чтобы она имела столбик размером 2,5-
3 см.
Среду засевают агаровой культурой бактерий вначале на скошенную
поверхность, а затем уколом в столбик. В случае образования сероводорода среда в
столбике окрашивается в черный цвет. При отрицательном результате почернения
среды не наступает.
5. Реактивы для обнаружения индола.
5.1. Реактив Эрлиха.
Состав: Пара-диметиламинобензальдегид - 1 г
Спирт этиловый 96° - 95 куб.см
Соляная кислота концентрированная - 20 куб.см
Приготовление и хранение: альдегид растворяют в спирте, затем
добавляют кислоту; хранят реактив в закрытом темном флаконе.
5.2. Реактив Ковача.
Состав: Пара-диметиламинобензальдегид - 5 г
Спирт амиловый - 75 куб.см
Соляная кислота концентрированная - 25 куб.см
Приготовление и хранение: альдегид растворяют в спирте при нагревании в
водяной бане (50-55 °С), после остывания смеси добавляют кислоту; хранят реактив при
температуре 4-6 °С.
Применение реактивов: к двухсуточной культуре бактерий в бульоне Хоттингера
добавляют 0,5 куб.см реактива Эрлиха или Ковача, пробирки встряхивают и через 1-2
мин. учитывают результаты. В случае образования индола верхний слой жидкости
приобретает красно-малиновый цвет, при отрицательной реакции он окрашивается в
желтый цвет.
5.3. Индикаторные бумажки для определения индола.
Предварительно готовят следующий реактив:
Парадиметиламинобензальдегид - 5 г
Ортофосфорная кислота концентрированная - 10 куб.см
(НзРО4)
Спирт этиловый 96 ° - 50 куб.см
Полученный реактив переливают в эмалированный металлический кювет, в который
помещают кусочки фильтровальной бумаги. Смоченные реактивом бумажки
высушивают на воздухе при комнатной температуре, затем нарезают полосками
размером 0,7-0,8 х 10-12 см. Бумажки имеют желтый цвет. Хранят их в банке из темного
стекла, закрытой резиновой или корковой пробкой.
Для приготовления индикаторных бумажек можно использовать реактив Эрлиха
или Ковача.
Применение: после посева изучаемой культуры бактерий в бульон Хоттингера или
МПБ помещают в пробирку полоску индикаторной бумажки, верхний конец которой
прижимают ватной пробкой. Нижний конец бумажки должен быть на расстоянии не
менее 2-3 см от поверхности среды. Засеянные пробирки инкубируют в термостате в
течение двух суток. При наличии индолообразования нижний конец индикаторной
бумажки окрашивается в красно-малиновый цвет, при отрицательной реакции цвет
бумажки не изменяется.
6. Среда с фенилаланином.
Для определения способности бактерий дезаминировать фенилаланин
используют коммерческую сухую среду, которую готовят по прописи, указанной на
этикетке, или среду приготовленную по следующему рецепту:
Дрожжевой экстракт сухой - 3 г
ДL-фенилаланин - 2 г
(или L-фенилаланин — 1 г)
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный (Na2HPO4 x 2H2O) - 1 г
Натрий хлористый (NaCI) - 5 г
Агар-агар - 12 г
Вода дистиллированная - 1000 куб.см
Компоненты растворяют в воде при нагревании, рН не
устанавливают, среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр,
разливают в пробирки по 3-4 куб.см и стерилизуют при 0,5 атм. в
течение 15 мин. После стерилизации среду скашивают.
Применение: к одно-двухсуточной культуре на среде с фенилаланином в
наклонном положении добавляют 10-12 капель 10% раствора хлорного железа (FеСl3 х
6Н2О). При положительной реакции через 2-3 мин. культура окрашивается в зелено-
синий или зеленовато-голубой цвет, при отрицательной реакции цвет культуры не
изменяется.
7. Среда Кларка для реакций с метилротом и Фогес-Проскауэра.
Состав: Пептон ферментативный - 5 г
Калий фосфорнокислый
двузамещенный (К2НРО4х3Н2О) - 5 г
Глюкоза - 5 г
Вода дистиллированная - 1000 куб.см
Приготовление: после растворения компонентов в воде устанавливают
рНсреды 6,9-7,0, затем кипятят ее 2-3 мин, фильтруют через бумажный фильтр,
разливают в пробирки по 5 куб.см и стерилизуют при 0,5 атм. в течение 15 мин.
Применение: для постановки реакции с метилротом из пробирки с двухсуточной
культурой бактерий в среде Кларка отсасывают в чистую сухую пробирку 2,5 куб. см
жидкости, добавляют к ней 8-10 капель индикатора метилрота, пробирку встряхивают,
после чего учитывают реакцию. Изменение цвета культуры зависит от величины рН :
розовое окрашивание (при рН ниже 5,0) означает положительную реакцию, желтое
окрашивание (при рН выше 6,0) - отрицательную реакцию, светло-оранжевое
окрашивание (при рН 5,0-6,0) — сомнительную реакцию.
Состав индикатора метилрота:
Метиловый красный - 0,01 г
Спирт этиловый 96° - 30 куб.см
Вода дистиллированная - 20 куб.см
Приготовление: навеску краски растворяют в спирте, затем добавляют воду и
смесь размешивают. Хранят индикатор в темном месте под притертой пробкой.
Для постановки реакции Фогес-Проскауэра к 2,5 куб.см культуры бактерий
добавляют в начале 1 куб.см 6%-ного спиртового раствора альфа-нафтола, а затем
0,4 куб.см 40%-ного водного раствора КОН, пробирку тщательно встряхивают и
спустя 3-5 мин. учитывают результаты. При наличии в культуре
ацетилметилкарбинола она окрашивается в розовый цвет - положительная реакция,
окраска культуры в желтый цвет свидетельствует об отрицательной реакции, при
сомнительной реакции культура окрашивается в светло-оранжевый цвет.
Состав реактивов для реакции Фогес-Проскауэра:
а) альфа-нафтол (С10Н8О) - 30 г
Спирт этиловый 96° - 500 куб.см
б) Калий гидроокись (КОН) - 120 г
Вода дистиллированная - 300 куб.см
8. Среды для предварительной идентификации культур
лактозоотрицательных бактерий
8.1. Среда Олькеницкого.
Состав: Лактоза -10г
Сахароза -10г
Глюкоза - 1 г
Аммоний-железо (11) сульфат - 0,2 г
(FeSo4 x (NH4)SО4 х 6Н2О)
Натрий тиосульфат - 0,3 г
(Na2S2O3 x 5H2О)
Мочевина -10г
Феноловый красный
(0,4% водный раствор) - 4 куб.см
Агар питательный сухой - 25 г
Вода дистиллированная - 1000 куб.см
Приготовление: компоненты растворяют в небольшом объеме дистиллированной
воды нагретой до температуры 45-50 °С; сухой питательный агар расплавляют в
отдельной посуде в остальной части дистиллированной воды при нагревании, затем
смешивают растворы солей и расплавленного агара, фильтруют через марлевый
фильтр, устанавливают рН 7,2-7,4, после чего добавляют раствор индикатора и
тщательно размешивают его; готовую среду разливают в пробирки по 6-7 куб.см и
стерилизуют текучим паром дробно в течение трех суток ежедневно по 20 мин.
Стерильную среду скашивают таким образом, чтобы столбик был не менее 2-2,5 см.
Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.
Применение: для посева используют агаровую культуру бактерий, которую
засевают бактериологической петлей вначале на поверхность скошенной части среды
(косяка), затем уколом в столбик. Засеянные пробирки инкубируют при 37-38 °С в
течение 24-48 часов.
В культурах, ферментирующих только глюкозу, столбик окрашивается в
желтый цвет, косяк имеет розовый цвет. В культурах, ферментирующих глюкозу, а
также лактозу и сахарозу или только один из последних двух Сахаров, столбик и косяк
окрашиваются в желтый цвет. Культуры, расщепляющие мочевину, окрашивают
столбик и косяк в красный цвет; при образовании сероводорода столбик (или часть его)
приобретает черный цвет. Газообразование устанавливают по наличию трещин и
разрывов в столбике среды.
Среда Клиглера.
Агар Клиглера готовят из сухой коммерческой среды согласно рецепту, указанному
на этикетке.
При отсутствии готовой среды ее приготовляют по следующему рецепту:
Лактоза -10г
Сахароза -10г
Глюкоза - 1 г
Железо сернокислое (FeSО4 х7НгО) - 0,2 г
Натрий тиосульфат (Na2S2О3 х 5Н2О) - 0,08 г
Натрий сульфит (Na2SO3) - 0,04 г
Феноловый красный
(0,2% раствор в 50% этиловом спирте - 12 куб.см
Агар питательный сухой - 20 г
Вода дистиллированная -1000 куб.см
Порядок и последовательность растворения компонентов среды, величина рН,
объем готовой среды в пробирках и режим стерилизации такие же, как и при
приготовлении среды Олькеницкого. Готовая среда имеет буровато-красный или
оранжево-красный цвет.
Применение: условия посева культур бактерий, время инкубирования
пробирок и характер изменений в столбике и на косяке среды аналогичны тем, которые
наступают в среде Олькеницкого.
.gif)