МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТОВ И НИТРАТОВ В КОРМАХ,ОВОЩАХ, БАХЧЕВЫХ КУЛЬТУРАХ,
КРОВИ, ПАТОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ
1. Принцип метода
2. Метрологическая характеристика метода
З. Реактивы и растворы
4. Приборы и посуда
5. Построение калибровочных кривых
6. Ход определения
7. Проведение определения
КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
1. Принцип метода
2. Реактивы и растворы
3. Приборы и посуда
4. Подготовка проб к анализу
5. Ход анализа
6. Колориметрированне проб
7. Расчет результатов анализа
ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ ГЕМОГЛОБИНЦИАНИДНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНА КРОВИ ЖИВОТНЫХ,
В ТОМ ЧИСЛЕ ПТИЦЫ
Общие сведения
1. Оборудование, реактивы и растворы
2. Подготовка к анализу
З. Проведение анализа
4. Обработка результатов
5. Оценка результатов
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТОВ И НИТРАТОВ В КОРМАХ,
ОВОЩАХ, БАХЧЕВЫХ КУЛЬТУРАХ, КРОВИ, ПАТОЛОГИЧЕСКОМ
МАТЕРИАЛЕ, МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ
(Утверждена Главным управлением ветеринарии
Госагропрома СССР 18 июня 1986 г.)
1. Принцип метода
Метод определения нитритов основан на фотометрическом измерении ин-
тенсивности окраски азосоединения розово-малинового цвета, образующегося
при реакции нитритов с альфа-нафтиламином и сульфаниловой кислотой (реак-
тив Грисса) в кислой среде после водного извлечения их из исследуемых проб.
Реакция специфична для нитритов.
Метод определения нитратов основан на водном извлечении их из исследуе-
мых проб, количественном восстановлении нитратов в нитриты и последующем
определении нитритов с реактивом Грисса.
2. Метрологическая характеристика метода
Предел определения нитритов составляет 0,05 мг/кг (мг/л), степень опре-
деления нитритов 90 ± 10 %'
Предел определения нитратов составляет 0,5 мг/кг (мг/л), степень опраде-
ления нитратов 83 ± 17 %.
З. Реактивы и растворы
Сульфаниловая кислота, ч. д. а., ГОСТ 5821-69.
Альфа-нафтиламин, ч. д. а., ГОСТ 8827-57.
Барий сернокислый, ч. д. а., ГОСТ 3158-75.
Цинковая пыль, порошок цинка.
Лимонная кислота, х. ч. или ч. д. а., ГОСТ 3652-69.
Марганец сернокислый, ч. д. а., ГОСТ435-67.
Натрий азотистокислый (№?*0,), х. ч., ГОСТ4197-6б.
Калий азотнокислый (ККО з ) , х. ч. , ГОСТ 4 2 1 7 -65 .
Сульфаминовая кислота, т. ч., ТУ 649-2437-79 или ТУ 6-092437-79.
Уксусная кислота концентрированная (ледяная) , ГОСТ 61.-69.
12 %-ный водный раствор уксусной кислоты.
1%-ый водный раствор сульфаминовой кислоты.
Уголь активированный марки Б или уголь активированный в таблетках (ап-
течный).
Натрий гидроокись, х. ч., ГОСТ4328-77.
Цинк сернокислый, ч. д. а., ГОСТ4374-77.
Приготовление реактива Грисса:
а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12 %-ноге раствора
уксусной кислоты;
б) 0,1 г альфа-афтиламина растворяют (при нагревании) в 20 мл дистилли-
рованной воды, фильтруют и смешивают со 150 мл 12 %-нога раствора уксусной
кислоты.
Перед употреблением одну часть раствора "а" смешивают с равной по объему
частью раствора "б". Растворы "а" и "б" хранят отдельно в холодильнике, при
необходимости - в течение 6 мес.
Приготовление стандартного раствора нитрита натрия: 0,15 г высушенного
до постоянной массы при температуре 80 "С *АРГО, растворяют в 1 л дистилли-
рованной воды, свободной от нитритов. 1 мл этого раствора содержит 0,1 мг
(100 мкг) НО,. Раствор хранят в холодильнике, он устойчив в течение месяца.
Приготовление рабочего раствора нитрита натрия: 25 мл полученного стан-
дартного раствора переносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки
дистиллированной водой. Раствор должен быть свежеприготовленным, 1 мл его
содержит 0,005 мг (5 мкг) Коз. Этот раствор используют для построения кали-
бровочной кривой.
Приготовление стандартного раствора нитрата калия: растворяют 1,63 г нит-
рата калия, высушенного до постоянной массы при 105гр.С, в дистиллированной
воде в мерной колбе на 1 л и доводят объем раствора до метки дистиллированной
водой. 1 мл этого раствора содержит 1 мг нитрат-ионов (Коз). Раствор можно
хранить в холодильнике в течение Э мес.
Приготовление рабочего раствора нитрата калия: в мерную колбу на 100 мл
переносят пипеткой 1 мл стандартного раствора нитрата калия и доводят объем
раствора в колбе до метки 12%-ным раствором уксусной кислоты. 1 мл этого
раствора содержит 0,01мг (10 мкг) Коз. Раствор должен быть свежеприготов-
ленным. Этот раствор используют для построения калибровочной кривой.
Приготовление реактива для восстановления нитратов в нитриты:
а) барий сернокислый, высушенный при 100гр.С до постоянной массы, - 100 г;
б) марганец сернокислый, прокаленный при 200 гр.С в течение часа, - 10 г1
в) цинковая пыль - 2 г;
г) лимонная кислота - 75 г;
д) сульфаниловая кислота - 4 г;
е) альфа-нафтиламин - 2 г.
Каждый реактив тщательно растирают в ступке, затем к реактиву "а" в-ступ-
ке последовательно добавляют реактивы "б", "в", "д" "е", "г" и тщательно пере-
мешивают до получения однообразной массы. Полученный реактив хранят в склян-
ке из темного стекла, он пригоден для использования в течение 2 лет.
Приготовление 12 %-ного раствора уксусной кислоты: 1.20 мл ледяной уксус-
ной кислоты смешивают с 880 мл дистиллированной воды.
Приготовление 1%-ного раствора сульфаминовой кислоты: 1 г сульфамино-
вой кислоты растворяют в 99 мл дистиллированной воды.
Приготовление 0,5 М раствора гидроокиси натрия: 20 г КаОН растворяют в
небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят
объем в колбе до метки дистиллированной водой.
Приготовление 5 %-ного раствора сульфата цинка: 5 г сульфата цинка раство-
ряют в 95 мл дистиллированной воды.
4. Приборы и посуда
Химические пробирки; пробирки с притертыми пробками; центрифужные
пробирки; пипетки на 1, 5, 10, 20 мл; мерные колбы на 100 и 1000 мл; коничес-
кие колбы на 100, 250 мл; химические стаканы на 100, 200 мл; мешочки для
диализа или пленка для диализа N (выпускается картонажными фабриками);
цилиндры на 10, 50 и 100 мл; химические воронки; песочные часы на 2 мин;
фотоэлектроколориметр; центрифуга на 5000-6000 об/мин; фильтры обеззо-
ленные среднепористые.
Пленку или мешочки для диализа перед использованием для анализа поме-
щают на 30-40 мин в дистиллированную воду. Во всех случаях при проведении
диализа пленку следует брать с запасом по отношению к пробе так, чтобы узел
мешочка при проведении диализа не был опущен в воду.
5. Построение калибровочных кривых
Калибровочная кривая для определения нитритов: в а химических проби-
рок наливают рабочий раствор нитрита натрия в количествах, указанных в таб-
лице. Затем в пробирки наливают дистиллированную воду до объема 10 мл, при-
ливают по 1 мл реактива Грисса и энергично встряхивают.
Таблица для приготовления шкалы стандартов на нитриты
№ Количеством Содержание NО N Количеством Содержание NO
про- рабочего 2 про- рабочего 2
бирки раствора, мг мкг бирки раствора, мг мкг
мл мл
1 0,1 0,0005 0,5 7 1,2 0,006 6,0
2 0,2 0,0010 1.0 8 1,4 0,007 7,0
3 0,4 0,0020 2,0 9 1,6 0,008 8,0
4 0,6 0,0030 3,0 10 1,8 0,009 9,0
5 0,8 0,0040 4.0 11 2,0 0,010 10,0
6 1,0 0,0050 5,0
Для построения калибровочной кривой через 15 мин после начала окраши-
вания определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре
при зеленом светофильтре (длина волны 540 им), кюветы -Юмм, раствор для
сравнения - дистиллированная вода.
Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрит-ионов (мкг), а на
оси ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят
кривую через точки пересечения.
Эта же шкала стандартов может быть использована для визуального сравне-
ния с опытными пробами.
Калибровочная кривая для определения нитратов. Для приготовления шкалы
стандартов в 7 химических пробирок с притертыми пробками или в 7 центрифуж-
ных пробирок с притертыми пробками последовательно прибавляют по 0,3 г
реактива для восстановления нитратов, затем приливают рабочий раствор и
12 %-кую уксуадую кислоту в количествах, указанных в таблице (общий объем
составляет 10 мл) .
Таблица для прнготовлснн шкалы стандартов на нитраты
N Количество ра- Содержание NО Количество
пробирки бочего раствора, 2 1%-ной уксусной
мл мг мкг кислоты,мл
1 0,0 0,0 0,0 10,0
2 1,0 0,010 10 9,0
3 2,0 0,020 20 8.0
4 4,0 0,040 40 6,0
5 6,0 0,060 60 4,0
6 8,0 0,080 80 2,0
7 10.0 0,100 100 0.0
Затем пробирки или центрифужные пробирки закрывают пробками и энер-
гично встряхивают в течение ровно 2 мин. Через 10 мин пробы центрифугируют в
центрифужных пробирках при 5-6 тыс. об/мин в течение 5 мин. Доле проводят
колориметрическое определение интенсивности окраски раствора при длине волны
540 им, кюветы 10 мм, раствор для сравнения - 12-ный раствор уксусной кис-
лоты, обработанный как пробы сухим восстановителем и прошедший центрифу-
гирование, - пробирка № 1.
Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрат-ионов (мкг), а на оси
ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят кри-
вую через точки пересечения.
Эта же шкала стандартов может быть использована для визуальных опре-
делений.
6. Ход определения
К о р м а. Для исследования измельчают пробу кормов и берут навеску
2-10 ч. Извлечение нитритов и нитратов из проб кормов проводят методом диа-
лиза. Для этого точно отмеривают 50-100 мл дистиллированной воды и исполь-
зуют этот объем для всех дальнейших операций с пробой. Пробу помещают в ме-
шочек или пленку для диализа, приливают туда небольшое количество дистил-
лированной воды из первоначального объема (50 или 100 мл). Воды приливают
столько, чтобы она хорошо смочила пробу. Далее пленку завязывают в виде ме-
шочка, весь оставшийся объем дистиллированной воды (от 50 или 100 мл) нали-
вают в химический стаканчик, опускают мешочек в стакан таким образом, чтобы
полностью погрузить пробу в воду, и оставляют ее для проведения диализа в
течение 1,5-2 ч. Затем, не вынимая мешочков из стаканов, пипеткой отбирают
10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и проводят
анализ, как описано ниже.
Кровь, органы и ткани животных.
Для анализа берут 20-50 мл крови, 2-10 г органов или тканей животных,
помещают пробу в диализный мешочек и опускают в химический стаканчик,
в который наливают соответственно 50-100 мл прокипяченной горячей ди-
стиллированной воды. Через 1,5-2 ч пипеткой отбирают из стакана 10 мл
диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и про-
водят анализ, как описано ниже.
Если раствор в стакане после диализа имеет окраску или муть, анализ сле-
дует проводить после удаления пигментов или мути. Пигменты, окрашивающие
диализат, удаляют путем фильтрования небольшого объема диализата через во-
ронку с бумажным фильтром, заполненным на 2\3 активированным углем. Уголь
на фильтре предварительно промывают 50 мл прокипяченной дистиллированной
воды, которую отбрасывают. Затем через этот фильтр отфильтровывают объем
диализата, необходимый для анализа на нитриты и нитраты. В случае необходи-
мости проводят повторное фильтрование этого раствора через свежую порцию
активированного угля, промытого водой, до полного исчезновения окраски
диализата.
При наличии в диализате мути проводят осаждение белков смесью 0,5 М раст-
вора КаОН и 5 %-ного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2 :5. Для
этого отбирают из стакана 30 мл диализата, переносят его в другой стаканчик
или колбу, добавляют 10-20 мл вышеуказанной смеси. После выпадения осадка
диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают 5 мл для анализа
на нитриты и 10 мл для анализа на нитриты.
В этом случае при расчете по формуле содержания нитратов и нитритов за
общий объем фильтрата следует принимать сумму объема диализата, оставшегося
в первом стаканчике (20 мл), и объема фильтрата, изморенного после осаждения
белков и фильтрования.
Молоко, молозиво, обрат, сухое молоко, заменитель цельного молока (3 Ц М).
Отбирают 20-50 мл молока или молозива, переносят в пленку для диализа и при-
ливают туда 2-4 мл 12%-ной уксусной кислоты, перемешивают содержимое стеклянной
палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50-100 мл горя-
чей прокипяченной дистиллированной воды. Затем через 1,5-2 ч отбирают 5 мл
диализата для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты и проводят
анализ, как описано ниже. В том случае, если в растворе после диализа есть
муть, необходимо провести осаждение белков. Для этого отбирают 20-30 мл ди-
ализата, добавляют 10-20 мл смеси 0,5 М раствора КаОН и 5%-ного раствора суль-
фата цинка в объемном отношении 2:5. После выпадения осадка диализат фильтруют,
измеряют объем фильтрата и отбирают пипеткой 5 мл для анализа на нитраты и
10 мл для анализа на нитриты.
Общий объем диализата при этом будет составлять сумму первоначального
оСЬема диализата, оставшегося в первом стакане и изморенного после фильтро-
вания объема.
Сухого молока, ЗИМ для анализа берут 2-5 г, помещают в пленку для диа-
лиза, хорошо смачивают пробу небольшим объемом дистиллированной воды,
приливают туда 2-4 мл 12%-ной уксусной кислоты, перемешивают стеклянной
палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50-100 мл
горячей дистиллированной воды, диализ проводят в течение 1,5-2 ч. При расчете
общего объема воды необходимо учесть объем воды, взятый для смачива-
ния пробы.
Анализ проводят, как описано для проб молока.
Обрата для анализа берут 20-50 мл, приливают к нему 20-50 мл дистилли-
рованной воды, хорошо перемешивают в течение 10 мин и отбирают 5 мл для
анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты. Если в растворе есть муть
или опалесценция, необходимо проводить осаждение белков, как указано выше.
Картофель ,сахарная свекла, огурцы, капуста,лук,редька и другие овощи и
бахчевые культуры, дающие с водой не окрашенные растворы. После измельче-
ния проб берут навеску 2-10 г, помещают в колбу и заливают 50-100 мл дистилли-
рованной воды. Перемешивают в течение 10-15 мин и отбирают аликвотные коли-
чества для анализа на нитраты и нитриты. В том случае, если раствор имеет окрас-
ку. Проводят фильтрование небольшого объема экстракта через активированный
уголь, как описано выше.
7. Проведение определения
После того как в пробирку отобрано 10 мл диализата для анализа на нит-
риты, туда добавляют 1 мл реактива Грисса (раствор "а" смешивают с раствором
"б" в равных объемных частях) , встряхивают содержимое пробирки и через 15 мин
после появления окраски проводят измерение оптической плотности раствора на
фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) против
дистиллированной воды в кюветах с рабочей длиной 10 мм.
Для анализа на нитраты отбирают 5 мл диализата в пробирку с притертой
пробкой, в которую предварительно насыпано 0,3 г сухого восстановителя, при-
ливают туда же 5 мл 12 %-ной уксусной кислоты, закрывают пробирку пробкой
и энергично встряхивают ее в течение точно 2 мин.
В параллельную пробирку насыпают 0,3 г сухого восстановителя и наливают
10 мл 12 %-ной уксусной кислоты, закрывают ее пробкой и встряхивают в тече-
ние 2 мин (пробирка для сравнения) при измерении оптической плотности пробы.
Через 10 мин переливают содержимое пробирок в центрифужные пробирки
и центрифугируют при 5-6 тыс. об/мин в течение 5 мин. После этого проводят ко-
лориметрирование проб на ФЭКе при 'зеленом светофильтре (длина волны 540 нм,
кюветы, с рабочей длиной 10 мм). В качестве раствора для сравнения используют
"холостой" раствор - раствор уксусной кислоты, обработанный сухим восстано-
вителем, как описано выше.
В том случае, если в пробах устанавливается наличие большого содержания
нитритов - свыше 20 мкг (интенсивная окраска в пробирке) , их следует удалять,
так как они несколько завышают результаты определения нитратов. Для удаления
нитритов к диализату в стакане, соответственно 50 или 100 мл, прибавляют 2-4 мл
1 %-ного раствора сульфаминовой кислоты, перемешивают раствор стеклянной
палочкой и оставляют на 5 мин. После этого отбирают 5 мл диализата для анализа
на нитраты и проводят анализ, как описано выше. При расчетах учитывают увели-
чение общего объема пробы.
После колориметрирования проб по соответствующим калибровочным кри-
вым находят количество нитритов и нитратов, подставляют их в формулу для
расчета (в мкг) и определяют содержание нитратов и нитритов.
Если при определении нитратов образуется очень интенсивная окраска, не
укладывающаяся при определении оптической плотности в пределы калибровоч-
ной кривой, необходимо повторить определение.взяв меньшее аликвотное коли-
чест во диализата для анализа, например 0,1 мл, и довести анализируемый объем
до 10 мл 12 %41ой уксусной кислотой. Далее провести анализ, как указано выше,
учитывая при расчетах разведение этого раствора.
Однако, если определяется очень высокое содержание нитратов (г/кг), необ-
ходимо повторить анализ данной пробы, соответственно уменьшая навеску и уве-
личивая объем дистиллированной воды для диализа. Можно также после прове-
дения диализа в первый раз и установления высокого содержания нитратов при-
бавить в стакан к прежнему диализату, в котором находится мешочек с пробой»
еще 100 мл дистиллированной воды и провести дополнительный диализ в тече-
ние часа. После этого взять аликвотное количество для анализа и провести анализ
на нитраты. При расчетах необходимо учесть это разведение диализата, в данном
случае в 2 раза, т. е. общий объем диализата при этом составил не 100, а 200 мл.
8. Расчет результатов анализа
Расчет результатов анализа проводят по формуле
B * Y
X= -------1---
A * Y
2
где X - содержание нитритов (нитрит-ионов) или нитратов (нитрат*онов), мг/кг;
В - содержание нитрит-ионов или нитрат-ионов, найденных по соответствующим
калибровочным кривым, мкг; А - навеем анализируемого образца, г; У -
общий объем фильтрата, мл (соответственно 50, 100 мл или другие объемы с
учетом разведений) ; У, - объем фильтрата, взятый для анализа, мл (5 или 10 мл
соответственно) .
Поскольку при диализе однородная равновесная концентрация минеральных
солей устанавливается во всем объеме раствора (в стакане и в растворе в диализ-
ном мешочке), при расчете принимается во внимание весь взятый для анализа
объем раствора или дистиллированной воды для анализа.
КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНА
В КРОВИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
1. Принцип метода
Метод основан на сравнительном измерении оптической плотности растворов
исследуемой крови с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина)
и параллельной пробы крови, в которой весь оксигемоглобин окислен до мет-
гемоглобина феррицианидом калия, с использованием фотоэлектроколориметра
при красном светофильтре.
2. Реактивы и растворы
Аммиак водный (NH OH), ГОСТ 3760-64.
Калий железосинеродистый (феррицианид калия, соль кровяная красная) ,
ГОСТ 4206-65.
Гепарин (25 000 ед.) .
Трилон Б (комплексен III, хелатон, двунатриевая соль ЭДГА - двунатрие-
вая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты).
0,25 %-ный раствор аммиака готовят, добавляя к 1 мл аммиака 99 мл дистил-
лированной воды. Насыщенный раствор феррицианида калия готовят, растворяя
70 г этой соли в 100 мл дистиллированной воды. Раствор можно хранить не более
недели. Раствор гепарина готовят путем прибавления к 5 мл гепарина 20 мл дис-
тиллированной воды. Раствор трилона Б готовят путем растворения 50 г препа-
рата в 500 мл дистиллированной воды, подогревая раствор при температуре 80 *С
до полного растворения. Теплый раствор фильтруют через микропористый стек-
лянный фильтр № 3 или 4 или через 4 слоя фильтровалыгой бумаги.
3. Приборы и посуда
Химические пробирки.
Пипетки на 1,10 мл.
Химические воронки или воронки со стеклянным фильтром № 3 или 4.
Фотоэлектроколориметр.
4. Подготовка проб к анализу
Для анализа у исследуемых животных берут по 1-2 мл крови, помещают
ее в пробирку и стабилизируют кровь, добавив туда 2-3 капли раствора гепа-
рина или трилона Б, перемешивают раствор и закрывают пробирки пробками.
Анализ проб на содержание метгемоглобина лучше проводить непосрад-
ственно после доставки проб, но при необходимости стабилизированную кровь
хранят в холодильнике при температуре 2-4 гр.С
Перед исследованием кровь тщательно перемешивают.
5. Ход анализа
В 2 химические пробирки наливают по 7,3 мл 0,25-ного раствора аммиака
и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови (из одной пробы крови). В одну из
пробирок (пробирка № 2) добавляют 1-2 капли насыщенного раствора ферри-
цианида калия, оставляют на 10 мин обе пробирки, а затем определяют величину
светопоглощения (экстинцию) обоих растворов, используя для сравнения
0,25%-ный раствор аммиака.
В первой пробирке (пробирке N 1) определяют величину светопоглощения
раствора крови с исходной концентрацией оксигемоглобина, или, что то же, ге-
моглобина, во второй (пробирка N 2) - величину светопоглощения раствора
крови, в которой весь оксигемоглобин (НЬО ) превращен в метгемоглобин
2
(МтНЬ) .
Как отмечено выше, содержание оксигемолюбина в исходной пробе крови
соответствует содержанию гемоглобина в ней.
Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка № 2) весь гемоглобин
полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора
феррицианида калия, величина светопоглощения раствора с содержанием мегге-
моглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина
(оксигемоглобина) .
6. Колориметрированне проб
Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках прово-
дят на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при краадом светофильтре. У ФЭК раз-
личных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при крас-
ном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭК-56 при работе с красным свето-
фильтром Н® 8 длина волны составляет 597 им, у спектрофотоэлектроколоримет-
ров ФЭК-56 ПМ и ФЭК-КФК-2 длины волн при работе с красным светофильтром
лежат в интервале 600-670 им.
Определение светопоглоадния растворов крови в обеих пробирках проводят
с использованием ФЭК различных марок при красном светофильтре в вышеприве-
денном интервале длин волн, используя для сравнения 0,25 %-ный раствор аммиа-
ка, в кюветах с рабочей длиной 10 мм.
Различия, связанные с измерением экстинций растворов крови при различаю-
щихся длинах волн при работе на ФЭК различных марок, корритаруются путем
введения в расчетную формулу коэффициента - величины приведенной экстинции
раствора крови с исходным уровнем окатамогообина (Е НЬО привед.), как
2
показано в разделе, - расчет результатов анализа. При расчете этой приведенной
величины используют изморенные опытным путем начадим светопоглощения
раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (Е HЬО ) - пробирка
2
М" 1 н величины светопоглощения раствора крови с предельным содержанием
метгемоглобина (Е МтНЬ) - пробирка № 2.
7. Расчет результатов анализа
Предварительно опытным путем на большой группе животных двух видов
установлена средняя величина светопоглощения раствора крови с исходным уров-
нем оксигемоглобина (ЕНЬО ), и средняя величина светопоглощения раствора
2
крови с полученным уровнем метагемоглобина Е МтНЬ) для овец и коров.
В пробах крови овец первая величина (Е НЬО,) составила 0,15, вторая
(Е МтНЪ) - 0,57; для крупного рогатого скота эти величины составляют соот-
ветственно О,1.7иО,79.
Поскольку гемоглобин в пробе крови полностью переводится в метгемогло-
бил добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, изменение света-
поглощения, равное 0,42 (0,57-0,15) для овец и 0,62 (0,79-0,17) для крупного
рогатого скота, соответствует 100 % содержания метгемоглобина.
Все эти данные были необходимы для выведения коэффициентов при рас-
чете содержания метгемоглобина в крови животных по данной методике.
По методике проводят определение светопоглощения растворов исследуемой
крови с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка № 1) и полученным
уровнем метгемоглобина (пробирка N 2) и рассчитывают содержание метгемогло-
бина в крови по нижеприведенным формулам, используя установленные коэф-
фициенты и расчетное приведенное значение светопоглощения раствора оксиге-
могло бина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофиль-
тре с различающимися длинами волн: X = (Е2 - Е1) ' 2,38 100 (1) для овец,
X = (Е2 - Е1) - 1,61 ' 100 (2) для крупного рогатого скота, где X - содержание
метгемоглобина в исследуемой пробе крови, %; Е, - приведенное значение све-
топоглощения раствора оксигемоглобина (Е НЪО ), расчет его приводится ниже;
2
Е1 - среднее значение величины светопоглощения раствора оксигемоглобина,
равное 0,15 для овец и 0,17 для крупного рогатого скота; 2,38 и 1,61. - расчетные
коэффициенты, найденные из средних величин светопоглощения растворов окси-
гемоглобина и метгемоглобина для овец и крупного рогатого скота (расчет их
также приводится далее) .
Значение Е, - приведенное значение светопоглощения раствора оксигемогло-
бина (Е НЬО2 =Е,) - находят из пропорции с использованием изморенных вели-
чин светопоглощения раствора крови с исходным содержанием оксигемоглобина
(пробирка N 1) и метгемоглобина (пробирка № 2) в опыте.
Е2 Е4 Е3 * Е4
----- = -----,откуда -----------
Е3 Е5 Е5
где Е2 - искомая величина - приведенное значение оптической плотности раство-
ра оксигемоглобина; Е3 - среднее значение оптической плотности раствора мет-
гемоглобина, соответственно 0,57 для овец для расчета Ез в формулу (1) и 0,79
для крупного рогатого скота в формулу (2); Е4 - измеренное значение оптичес-
кой плотности раствора оксигемоглобина (пробирка № 1); Е5 - измеренное зна-
чени оптической плотности раствора метгемоглобина (пробирка N 2) .
Значение Е2 подставляют в формулу (1) или (2) для расчета содержания
метгемоглобина в крови овец или крупного рогатого скота.
Если приведенное значение оптической плотности раствора окситемоглобина
(Е2) будет равно или меньше среяней величины оптической плотности раствора
оксигемоглобина (Е1 в формулах N 1. и 2), что объясняется индивидуальными
колебаниями содержания гемоглобина в крови, содержание метгемоглобина
в крови в этом случае будет равно или меньше 2,38 для овец и 1,61 для крупного
рогатого скота.
Коэффициенты 2,38 и 1,61. были рассчитаны из средних показателей оптичес-
кой плотности растворов метгемоглобина и оксигемогдобина в крови овец и
коров соответственно по формулам
100 * 0,01 100 * 0,01
------------ =2,38 ------------ =1,61
0,42 0,62
где 0,42 - изменение светопоглощения растворов крови овец с содержанием мет-
и оксигемоглобина (0,57-0,15), соответствующее 100% -ого содержанию мет-
гемоглобина в крови овец 0,01 - наименьший показатель оптической плотно-
сти, т. е.
0,42 - 100
0,01 - X.
Подобным образом рассчитан коэффициент для крупного рогатого скота.
ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ ГЕМОГЛОБИНЦИАНИДНЫЙ МЕТОД
ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНА КРОВИ ЖИВОТНЫХ,
В ТОМ ЧИСЛЕ ПТИЦЫ
Метод предназначен для химико-токсикологических, клинических и других
исследований свернувшейся (сгустков) и несвернувшейся (цельной) крови на
долю метгемоглобина в процентах по отношению к общему гемоглобину.
Методы основаны на уменьшении величины оптической плотности содержа-
щегося в исследуемом растворе крови метгемоглобина (гемоглобина) вследствие
перевода его в цианметгемоглобин (гемоглобинцианид) и вычисления процент-
ного соотношения этой величины к такому же показателю 100 %-ного метгемогло-
бина того же раствора крови.
Принцип определения - фотоколориметрический по прямому определению
(установлению) величины уменьшения оптической плотности (Д дельта 630) раствора
крови в одной кювете.
Погрешность метода - не более 0,075 % при нормальнОл и 0,227 % при
71,1 %-ном содержании метгемоглобина от общего гемоглобина.
Выявляемость метода при оптической плотности 0,001 составляет не бо-
лее 0,3 %.
1. Оборудование, реактивы и растворы
1.1. Оборудование:
колориметр ефелометр фотоэлектрический типа ФЭК-56 М или другие при-
боры подобного типа с наличием светофильтра с длиной волны 625-670 нм;
центрифуга лабораторная на 4-8 тыс. об/мин типа ЦЛН-2 или ЦУМ-1 и др;
колбы мерные вместимостью 25 куб. см ;
пипетки на 1,5 и 10 куб.см ;
стаканчики стеклянные на 50 куб. см ;
пипетки глазные;
палочки стеклянные или пластмассовые.
1 .2 . Реактивы и растворы
ацетонциангидрин по ТУ 649-3558-81 или ГОСТ 13198-77, 10-%ый раствор
(объем/объем). Годен до 1 года;
вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;
калий железосинеродистый (соль кращая кровяная) по ГОСТ 4206-75,
х. ч., 10 %-{ый раствор. Годен 30 дней при хюнении в темном месте.
2. Подготовка к анализу
2. 1. П р и г о т о в л е н и е р а с т в о р а к р о в и.
2.1.1 сгустка крови. От свежего трупа животного (в том числе птицы)
или из патматериала (из сердца, крупных сосудов) берут в стаканчик сгусток
крови массой около 1 г, добавляют 9 см' воды и сгусток тщателыто разминают
чистым никелированным пинцетом до обесцвечивания комков фибрина. Затем
комки фибрина удаляют, а в стаканчик с гемолизатом эритроцитов приливают
15 см куб. воды.
2.1.2.Из цельной крови. В мерную колбу на 25 куб.см наливают около 20 куб см
воды, 1 куб. см (точно) гепаринизированной (декальцинированной трилоном Б или
оксалатной) крови, промывают внутренний канал пипетки несколько раз юдер-
жимым колбы (избегая образования пены), объем гемолизата эритроцитов в
колбе доводят водой до метки и тщательно перемешивают (разведение крови
в 25 раз) .
2.1.3. Гемолизаты из стабилизированной крови или сгустка крови перено-
сят в капроновые центрифужные патроны, центрифугируют 15-20 мин при
8 тыс. об/мин и исследуют не позднее 1 ч после центрифугирования.
З. Проведение анализа
3.1. Устанавливают в рабочее положение светофильтр с длиной волны 630 им.
В левый кюветодержатель помещают 1.0-миллиметровую кювету с водой, а в
правый - такую же кювету с 4 см' центрифугата раствора крови и устанавливают
правый измерительный барабан прибора точно на ноль (по красной шкале). От-
крывают световое окно с помощью рукоятки шторки и вращением левого бара-
бана добиваются установки стрелки микроамперметра на ноль.
В кювету с раствором крови вносят одну каплю раствора ацетонциангидрина
(АЦГ) и перемешивают содержимое кюветы стеклянной палочкой. При этом
взаимодействие метгемоглобина с АЦГ с образованием цианметгемоглобина за-
канчивается через 2-3 мин. Через 2-3 мин после прибавления раствора АЦГ
открывают световое окно прибора и правым измерительным барабаном устанав-
ливают стрелку микроамперметра на ноль. По красной шкале правого барабана
отсчитывают показатель уменьшения оптической плотности (Д1 дельта 30) раствора
крови.
3.2. Правую кювету освобождают от содержимого и 4-5 раз тщателюо про-
мывают водой. Затем ополаскивают кювету 0,5 куб.см раствора крови, наливают
4 куб.см того же раствора крови и устанавливают кювету в правый кюветодержа-
тель. К раствору крови в кювете добавляют одну каплю 10%-ного раствора крас-
ной кровяной соли (ККС), перемешивают другой чистой стеклянной палочкой
и оставляют стоять 3 мин. За это время весь кровяной пигмент превращается в
метгемоглобин.
Устанавливают правый измерительный барабан точно на ноль, а левый (не
открывая светового окна), устанавливают на отметку 0,4-0,6 по красной шкале.
Открывают шторку светового окна и левым барабаном точно устанавливают
стрелку микроамперметра на ноль.
К раствору крови в кювете прибавляют одну каплю раствора АЦГ, содер-
жимое кюветы перемешивают стеклянной палочкой, устанавливают первый бара-
бан на отметку 0,4 (грубая наводка, без открытия светового окна) .
Через 2-3 мин после прибавления раствора АЦГ открывают световое окно
и устанавливают правым измерительным барабаном стрелку микроамперметра
на ноль. По красной шкале правого барабана снимают показатель уменьшения
оптической плотности (Д2 дельта 30) раствора крови, в котором весь гемоптобин
был переведен в метгемоглобин.
4. Обработка результатов
4.1. Долю метгемоглобина (в %) к общему гемоглобину (общему пигменту)
крови вычисляют по формуле
Д1 дельта30 * 100
Ме t HЬ=------------------------
Д2 дельта30
где Д1 дельта 30 - показатель уменьшения оптической плотности раствора крови после
прибавления АЦГ;(Д2 дельта 30), - показатель уменьшения оптической плотности
100 %-наго метгемоглобинового раствора крови после прибавления АЦГ.
5. Оценка результатов
5.1. Для постановки диагеоза при отравлении животных и птицы метгемо-
глобинобразующими ядами определение доли метгемоглобина к общему гемог-
лобину является решающим диагностическим показателем.
Обнаружение в крови более 30 % метгемоглобина указывает на возможность
отравления, а более 60 % - на возможную причину падежа животного от отравле-
ния метгемоглобинобразующимивеществами (ядами).
5.2. Обнаружение в крови животного нормального содержания (до 5 %) мет-
гемоглобина исключает потребность проведения химико-оксикологических ис-
следований патматериала на метгемоглобинобразующие вещества (нитриты, берто-
летову соль, красную кровяную соль, анилин и др.). Однако для исключения
отравления животных нитрат-ионами (без их редукции в нитриты) необходимо
патматериал исследовать на нитраты.