МИНИСТЕРСТВО УТВЕРЖДАЮ: СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Руководитель Департамента И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ ветеринарии РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Российской Федерации (Минсельхозпрод России) В.М.Авилов ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ 03.11.99г. № 13-2-20/1036 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по ветеринарно-санитарному контролю качества заморожен- ной спермы быков-производителей с целью ее сертификации В целях ветеринарного контроля за качеством спермы быков- производителей проводят санитарную оценку замороженной спермы. На быков-доноров, от которых отбирают сперму для исследования, должны быть представлены данные о проведенных исследованиях с отри- цательными результатами согласно действующих ветеринарно-санитарных правил, утвержденных Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ (1993г.) на следующие инфекционные болезни: бруцеллез, туберкулез, па- ратуберкулезный энтерит, лептоспироз, инфекционный ринотрахеит, хла- мидиозный аборт, лейкоз, трихомоноз, кампилобактериоз. Сперму исследуют по следующим показателям: - определение общего количества микроорганизмов - микробное число в 1 куб.см спермы; - определение Коли-титра в 1 куб.см спермы; - наличие патогенных и условно патогенных микроорганизмов: эн- теропатогенные эшерихии, сальмонеллы, Ps. aeruginosa, Pr. vulgaris, грамотрицательные кокки, Staph. aureus, Str. faecalis, Str. pyogenes, анаэробы; - наличие патогенных грибов: Asp. fumigatus, Asp. flavus, Asp. niger, Asp. nidulans, Asp. terreus, Asp. vergicolor, Absidia corimbitera, Absidia ramosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Mucor pusillus, Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Rhizopus cohnii, Candida stellatoidea, Candida guilliermond, Candida parapsilosis, Candida pseudotropicalis, Candida krusei, Candida parakrusei. 1.ОТБОР ПРОБ СПЕРМЫ И ДОСТАВКА ИХ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.1. Для исследования отбирают пробы спермы при наличии вете- ринарных сопроводительных документов. 1.2. Взятие проб замороженной спермы для ветеринарно-санитарной оценки ее качества необходимо проводить с соблюдением правил асепти- ки, чтобы исключить контаминацию спермы микрофлорой. 1.5. Пробы спермы отбирают комиссионно, с участием представите- ля госветслужбы, владельца спермы быка-производителя и представителя организации по искусственному осеменению сельхозживотных. 1.4. Пробы отбирают над пламенем спиртовки стерильными пинце- тами в сухие стерильные пробирки или флаконы из-под антибиотиков и герметически закрывают стерильными пробками. 1.5. Отобранные пробы спермы помещают в сосуды Дьюара, пред- варительно продезинфицированные, наполненные жидким азотом не менее 2/3 емкости и обеспечивающие ее хранение в замороженном состоянии на все время транспортировки и хранения до начала исследования, но не ме- нее 20 дней. 1.6. Замороженная сперма быков должна быть отобрана для исследо- вания посерийно. 1.7. Серией замороженной спермы быков считают любое количество доз, полученных от одного производителя из одного или нескольких сме- шанных эякулятов, изготовленных за один технологический цикл, оформ- ленных одной датой, одним номером и документом. 1.8. Из хранилища формируют среднюю пробу замороженной спер- мы быка поквартально, в течение года, т.е. по 1-2 серии спермы, заготов- ленной в месяц. От каждой серии отбирают 4-8 доз, в зависимости от рас- фасовки спермы (0,5-0,25 см соответственно). 1.9. Пробу замороженной спермы, предназначенную для исследова- ния, маркируют с указанием номеров серии, клички и инвентарного номе- ра быка, дат замораживания спермы. 1.10. К направляемым для исследования пробам спермы прилагается сопроводительный документ, в котором должно быть указано; наименова- ние предприятия-изготовителя, наименование продукции, данные о благо- получии предприятия по инфекционным болезням и результаты последне- го обследования быков-производителей на вышеперечисленные инфекци- онные болезни, форма упаковки спермодоз, номера серий и дат заморажи- вания спермы и количество спермодоз в серии, подпись руководителя предприятия и лица, проводившего отбор проб спермы. 2. МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ 2.1. Подготовка к исследованиям. 2.1.1. Флаконы или пробирки с замороженной спермой вынимают из жидкого азота и оставляют при комнатной температуре до полного оттаи- вания проб. 2.1.2. Пайетты, ампулы, облицованные гранулы со спермой перед вскрытием обрабатывают ватным тампоном, смоченным спиртом- ректификатом. Стерильным пинцетом придерживают один конец пайетты, ампулы или облицованной гранулы, а другой конец срезают стерильными ножницами. Размороженную сперму выливают в стерильную сухую про- бирку. 2.1.3. Разведения для посевов спермы готовят следующим образом: к 9,0 куб.см стерильного 0,9% раствора хлористого натрия добавляют 1 куб.см оттаянной спермы. Тщательно перемешивают и готовят десятикратные раз- ведения, в зависимости от степени ожидаемой контаминации спермы, на- чиная с разведения 1:10, Каждое разведение спермы проводят с использованием одной пи- петки. Раствор набирают с помощью резиновой груши или полиэтиленово- го баллончика и тщательно (не менее трех раз) промывают пипетку рас- твором из той пробирки, в которую перенесли суспензию. 2.2. Определение общего числа (микробного числа) микроорганиз- мов в 1 куб.см спермы. 2.2.1. Сперму, подготовленную по п.2.1.3. высевают на одну из сле- дующих трех питательных сред: 2% мясопептонный агар с 1% глюкозы и 5% крови барана или крупного рогатого скота; агар Хоттингера или тиог- ликолевую среду (рецепты сред в приложении 1). 2.2.2. Разбавленную сперму переносят на среды (высевают) стериль- ной градуированной пипеткой в количестве 1,0 куб.см в чашки Петри (из рас- чета не менее трех чашек на каждое разведение) и равномерно распреде- ляют материал по всей поверхности агара покачиванием чашек. Чашки с посевами помещают в термостат при температуре 37±0,5°С и инкубируют в течение 48 часов. Подсчет колоний, выросших на поверхности агара и определение числа микробных тел в 1 куб.см (микробное числа) проводят по ГОСТ 20909.2-75. 2.3. Определение коли-титра. 2.3.1. Разбавленную по п.2.1.5. сперму в количестве 1 куб.см вносят в пробирку со средой Булира. Посевы выдерживают в термостате при температуре 44-45°С в течение 24 часов. В результате осмотра про- бирок устанавливают бродильный титр. К группе кишечной палочки относят все разновидности кишечной палочки, способные ферментировать жидкую среду, содержащую глюкозу и маннит с выделением кислоты и газа в течение 24 часов инкубации при температуре 45-44°С. 2.3.2. При отсутствии помутнения среды газообразования реакцию считают отрицательной. Изменение цвета среды (пожелтение, помутне- ние) и газообразование (пузырек в газовке), указывает на наличие в среде микробов из группы кишечной палочки. В этом случае реакцию считают положительной. 2.3.3. При наличии положительной реакции на бродильный титр проводят исследование на идентификацию кишечной палочки по ГОСТ 20909.2-75. 2.3.4. Коли-титром считают наименьший объем исследуемого мате- риала, в котором обнаружена одна кишечная палочка. Коли-титр выража- ют степенью разведения: 1:10-0,1; 1:100 - 0,01 и т.д. Исследование на наличие синегнойной палочки, анаэробной микрофлоры, грибов. 2.4.1. Для выделения синегнойной палочки исследуемый материал высевают на мясопептонный бульон с добавлением 1-2% сахара (глюкозы, лактозы) и инкубируют посевы в течение 6-7 суток в термостате при тем- пературе 37 ±0,5°С, проверяя рост каждые 1-2 дня. При росте микроб продуцирует водорастворимый пигмент пиоцианин, который постепенно окрашивает бульон в зеленовато-голубой цвет. На мясопептонном агаре он дает круглые голубовато-серые колонии. При микроскопии - грамотрица- тельная палочка. Основной признак культуры синегнойной палочки - по- ложительная хлороформная проба: к 18-ти часовой культуре добавляют 1,0 мл хлороформа. Культура, давшая положительную реакцию (окраска хло- роформа в синий цвет) относится к синегнойной палочке. 2.4.2. Для выделения анаэробных бактерий, помимо соответствую- щей среды и температурного оптимума, требуется создание бескислород- ных условий. Лучше всего для выращивания анаэробов применять среду Китт-Тароцци. Исследуемый материал засевают по 1-2 капли в 2 пробирки с указанной средой. Одну из пробирок, после посева материала, прогрева- ют в водяной бане при температуре 80°С в течение 20 минут для уничто- жения сопутствующей вегетативной микрофлоры. Затем засеянные про- бирки помещают в термостат при 37°С на 10 суток. На печеночном бульо- не учитывают интенсивность роста, характер осадка, а также наличие и степень газообразования. Дальнейшую идентификацию проводят по методикам исследования анаэробных микроорганизмов. 2.4.3. Для исследования на наличие грибов, чашки с высевами спер- мы на мясопептонном агаре после подсчета количества микробных тел ос- тавляют при комнатной температуре на 8-10 суток в месте, удаленном от прямых солнечных лучей. По истечении этого срока, чашки с посевами проверяют на наличие в них роста грибов. Идентифицирование выросших грибов проводят по "Методике микологического исследования и оценки спермы, применяемой при искусственном осеменении с/х животных" ут- вержденной ГУВ МСХ СССР 2.01.78 г. 2.5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ 2.5.1. Чашки с первичными посевами спермы, после учета числа вы- росших на них микроорганизмов, используют для выделения чистых куль- тур (изолятов) и последующей их идентификацией. 2.5.2. Изучают визуально морфологию колоний микроорганизмов, выросших на чашках с питательными средами: размер, форму, поверх- ность, цвет. 2.5.3. Из колоний, выросших на питательной среде, готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют и делят микроорганизмы, в за- висимости от окраски на грамположительные и грамотрицательные. 2.5.4. Для выделения чистой культуры, изолированную колонию од- ного вида или часть ее бактериологической петлей над пламенем горелки переносят в пробирки с мясопептонным бульоном (МПБ) и на поверхность скошенного мясопептонного агара (МПА) штрихом. Посевы инкубируют при температуре 37,5-0,5°С 24-48 часов. 2.5.5. Выделение чистой культуры необходимо для изучения куль- туральных и ферментативных признаков, по совокупности которых опре- деляется видовая принадлежность исследуемого микроба. 2.5.6. Изучение морфологических и культуральных свойств микро- бов. В посевах на МПА отмечают наличие пигмента и другие морфологи- ческие особенности. В посевах на МПБ отмечают рост бактерий с равно- мерным помутнением среды, придонный рост с образованием осадка на дне (скудным или обильным, крошковатым или хлопьевидным), образова- ние пигмента, наличие на поверхности бульона пленки или пристеночного кольца. 2.5.7. При изучении ферментативных свойств определяют наличие протео- литических ферментов, сахаролитических и других свойств. Для этого исследуемую культуру высевают на специальные диффе- ренциально-диагностические питательные среды. 2.6. Определение патогенности выделенных микроорганизмов. 2.6.1. Патогенность микробов определяют по гемолитическим, плаз- мо-коагулирующим свойствам и биопробе - способности убивать белых мышей. 2.6.2. Гемолитические свойства способность микробов гемолизиро- вать эритроциты крови определяют на чашках Петри с кровяным агаром. Для этого изолированную культуру микроба высевают на поверхность МПА, содержащего 5% крови. Посевы инкубируют при температуре 37+- 0,5°С в течение 48 часов. При наличии вокруг выросших колоний зон ге- молиза альфа или бетта - реакцию считают положительной. 2.6.3. Плазмокоагуляция - способность патогенных микробов (пре- имущественно стафилококков) свертывать цитратную плазму крови кро- лика. Реакцию плазмокоагуляцин проводят с использованием сухой стан- дартной плазмы кролика, в соответствии с общепринятой методикой ис- следований. Для постановки реакции берут 0,5 куб.см плазмы, разведенной 1:5, ко- торую переносят в стерильную пробирку и добавляют 18-20 часовую ага- ровую культуру изолята (культуру берут бактериологической петлей). Пробирки помещают в термостат при 37,5+-0,5° С и проверяют наличие свертывания плазмы через 1,2,5,18 и 24 часа. Патогенные микробы продуцируют фермент плазмокоагулазу, кото- рый свертывает плазму. Реакция считается положительной независимо от времени свертывания плазмы и вязкости сгустка. 3. САНИТАРНАЯ ОЦЕНКА ЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ. 3.1. Замороженную сперму считают пригодной для искусственного осеменения, если она получена от клинически здоровых быков-доноров и в ней не содержатся патогенные и условно патогенные микроорганизмы. 3.2. В замороженной сперме допускается содержание непатогенных микроорганизмов (не вызывающих гемолиз, плазмокоагуляцию, гибель мышей и не проявляющих рост в присутствии санирующих веществ в те- рапевтических дозах) до 500 м.т. в 1 куб.см, а коли-титр - выше 0,1 куб.см т.е. отрицательный. 3.3. При получении удовлетворительных результатов, соответст- вующих пп. 3.1 и 3.2 выдается ветеринарный сертификат на заморожен- ную сперму, исследованную в течение года от каждого быка для ее ис- пользования при искусственном осеменении коров. 3.4. В случае использования спермы от быка, находящегося на плем- предприятии исследование спермы от него проводят ежемесячно; к резу- льтатам по исследованию спермы прилагают ветеринарный паспорт о бла- гополучии быка по инфекционным болезням. Настоящие Методические указания разработаны Всероссийским НИИ контроля, стандартизации и сертификации ветпрепаратов и специа- листами Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ. Приложение ПАСПОРТ НА СПЕРМУ БЫКА 1. Название и адрес организации-владельца быка-производителя ____________________________________________________________ 2. Сведения о быке-производителе: порода _____________________________________________________ дата и место рождения ______________________________________ дата начала использования производителя_____________________ 3. Данные о сперме: дата получения эякулята и способ замораживания______________ ____________________________________________________________ (пайетты, гранулы) 4. Степень разбавления спермы; наличие санирующих препаратов, концентрация на 100 куб.см среды, состав среды: ____________ ____________________________________________________________ 5. Количество серий и доз замороженной спермы ______________ 6. Бык-производитель, от которого получена сперма, здоров и находится в хозяйстве, свободном в течение 12 месяцев от ин- фекционных болезней крупного рогатого скота; туберкулеза, па- ратуберкулеза, бруцеллеза, лептоспироза, лейкоза, инфекционно- го ринотрахеита, хламидиоза кампилобактериоза и трихомоноза. 7. Поголовье быков-производителей, где получена и заморожена сперма, находится под постоянным ветеринарным контролем и под- вергается: исследованиям на туберкулез, бруцеллез, лептоспироз, лейкоз, трихомоноз и кампилобактериоз - два раза в год; исследованиям на инфекционный ринотрахеит — ИРТ (кроме вакцинированных), хламидиоз, паратуберкулезный энтерит - один раз в год с отрицательными результатами; содержание, взятие и замораживание от них спермы проводится о соблюдением ветеринар- но-санитарных требований. Главный ветврач организации (подпись) Главный технолог организации (подпись) Приложение к ветеринарному сертификату Бык-производитель ____________________________________________ (кличка, инвентарный номер) исследован на следующие заболевания: 1.Туберкулез ________________________________________________ (дата, метод и результаты исследований) 2.Паратуберкулез______________________________________________ 3.Бруцеллез___________________________________________________ 4.Лептоспироз_________________________________________________ 5.Кампилобактериоз____________________________________________ 6.Трихомоноз__________________________________________________ 7.Лейкоз______________________________________________________ 8.Инфекционный ринотрахеит____________________________________ 9.Хламидиоз___________________________________________________ 10.Состав среды для замораживания спермы, санирующие препараты, дозы__________________________________________________________ 11.Количество доз_____________________________________________ 12.Дата отправки замороженной спермы__________________________ 13. Температура хранения отправляемой замороженной спермы_____ Ветеринарный сертификат выдан _____число____ месяц ______ год. Главный ветеринарный врач ___________________ (название организации) ___________________ (фамилия, инициалы) Главный технолог _________________ (фамилия, инициалы) ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Рецепты питательных сред, применяемых при микробиологическом исследовании замороженной спермы быка. 1.2% МПА с 1% глюкозы и 5% крови барана: мясопептонного бульона - 1,0 мл агара - 20,0 мл глюкозы -10,0 г цитрированной крови барана -50,0 мл рН среды - 7,0 - 7,2 2. Тиогликолевая среда дистиллированной воды - 1,0 л панкреатического гидролизата казеина - 15,0 г экстракта дрожжей - 5,0 г хлорида натрия - 2,5 г глюкозы - 5,0 г цистина - 0,75 г тиогликолевой кислоты или тиогликолята натрия - 0,3 мл агара - 20,0 г рН среды - 7,0 - 7,2 3. Среда Хоттингера: водопроводной воды - 800 мл перевара Хоттингера - 200 мл хлористого натрия - 0,4 г агара - 2,5 г рН среды - 7,6 - 7,8 4. Среда Булира: мясопептонного бульона - 100 мл маннита - 250 мг насыщенный водный раствор нейтральрота - до окрашивания смеси в вишнево-красный цвет рН среды - 7,0 - 7,4