МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ УТВЕРЖДАЮ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Заместитель начальника
(Минсельхозпрод России) Департамента ветеринарии
В.В.Селиверстов
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ
23 июня 1997 г. № 988
МЕДТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по определению уровня антител
к вирусу ньюкаслской болезни
в реакции торможения гемагглю-
тинации (РТГА)
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ.
1.1. Настоящие методические указания преднаяначены для серо-
логического контроля напряженности иммунитета к ньюкаслской бо-
лезни (НБ), оценки эффективности иммунизации, определения опти-
мальных сроков вакцинации (ревакцинации) птицы, а также для конт-
роля эпизоотической ситуации по НБ в хозяйствах.
1.2. Методика основана на обнаружении в сыворотке крови спе-
цифических к вирусу НБ антигел (антигемагглютининов) в реакции
торможения гемагглютинации.
1.3. Сроки серологического обследования поголовья определены
Наставлениями по применению вакцин против НБ и могут быть скор-
рекитированы, исходя из эпизоотической ситуации в конкретном хо-
зяйстве.
1.4. Исследованию подлежат не менее 25 проб сывороток крови
от птиц, взятых из различных мест птичника (зала) в объеме не ме-
нее 0,5 см(3).
1.5. Результаты каждого серологического исследования должны
быть зарегистрированы в специальном журнале и проанализированы
ветеринарным врачом хозяйства.
2. Методика постановки реакции торможения гемагглютинации
2.1. Оборудование и реактивы:
- антиген сухой вирусвакцины против НБ из штаммов "Ла-Со-
та", "В1" или "ГАМ-61" или экстраэмбриональная жидкость куриных
эмбрионов, ихфицированных этими штаммами, с гемагглютинирующим
титром не ниже 1:8;
- испытуемые сыворотки птиц;
- О,7- или 1%-ная взвесь эритроцитов петуха на физиологичес-
ком или фосфатно-буферном растворе (рН 7,2-7,4) для исследований в
микро- и макроварианте соответственно;
- пипетки мерные;
- микротитраторы одно- и восьмиканальные либой модели с варьи-
руемым или стабильным объемом в пределах 0,025-0,05 см(3);
2.2. Подготовка антигена.
2.2.1. Вакцину в ампулах (флаконах) ресупендируют в физио-
логическом растворе до исходного объема вируса.
2.3. Приготовление взвеси аритроцитов петуха.
Кровь берут из подкрыльцовой вены во флаконы с 2-З%-ным
растовором лимонно-кислого натрия на фзиологическом растворе (pH
7,2-7,4) в соотношении 1:2 , трижды отмывают физиологическим
раствором путем центрифугирования при 1500 об/мин 10 мин. Из
осадка эритроцитов на физиологическом растворе (рН 7,2-7,4) гото-
вят 0,7-или 1%-ную суспензию. Хранить суспензию можно в условиях
холодильника (+4*С) до появления признаков гемолиза эритроцитов.
Кроме нативных в работе могут быть ислользованы стабилизиро-
ванные (формалинизированные) эритроциты петуха.
2.4. Получение сыворотки крови.
2.4.1. Кровь берут из подкрыльцовой вены или путем скарифи-
кации гребня, собирают в стерильные пробирки, предварительно ув-
лажненные стерильным физиологическим раствором. Образовавшийся
сгусток отделяют от стенок тонким металлическим стержнем или пас-
теровской пипеткой и выдерживают при комнатной температуре
(18-20*С) в течение 12-18 ч или при темкратуре 37*С (термостат) в
течение 60 мин, а затем 8-10 ч при +4*С (холодильник). Отстоявшу-
юся сыворотку сливают в чистые пробирки и исследуют в РТГА.
Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотку крови
прогревают в водяной бане при 56*С в течение 30 мин.
2.5. Реакцию торможения гемагглютинации проводят в два этапа:
- определение гемагглютинирующего титра вируса в реакции ге-
магглютинации (РГА) для расчета рабочей дозы;
- определение титра антител в пробах сыворотки крови.
Реакцию ставят макро- или микрометодом.
2.5.1. Постановка реакции гемагглютинации.
Для постановки РГА готовят двукратные разведения вакцинного
вируса от 1:2 до 1:4096. С этой целью во все лунки одного ряда
полистероловой микропанели микротитратором разливают физиологи-
ческий раствор (0,05 или О,25 см3), в первую вносят в равном
объеме вакцинный вирус трехкратно пипетируюти и переносят 0,05 или
0,025 см3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки 0,05 или
0,025 см3 удаляюти обезвреживают в 2%-ном растворе едкого натрия.
После разведения вируса во все лунки вносят 0,7%-ную суспен-
зию эритроцитов петуха в объеме, равном исходному объему физиоло-
гического раствора. Микропанели аккуратно встряхивают и оставляют
при команатной температуре (18-20*С). Учет реакции проводят после
оседания эритроцитов в контроле.
Для контроля эритроцитов на спонтанную гемагглютинацию оп-
ределения времени учета реакции в две лунки с физиологическим
растворам (0,05 или 0,025 см3) добавляют равный объем эритроцитов.
РГА оценивают положительно при оcедании эритроцитов в виде
хорошо выраженного "зонтика", отрицательно - в виде "пуговки". За
титр вируса принимают его наибольшее разведение, дающее четко вы-
раженную агглютинацию в виде "зонтика". Получение нечетких ре-
зультатов может быть связано с изменившимся рН физиологического
раствора.
Реакция может быть поставлена макрометодом в полистероловых
макропанелях, для чего все компаненты берут в объме 0,2 см3. При
этом в работе используют 1%-ную суспензию эритроцитов петуха.
2.5.2. Для постановки РТГА готовят рабочую дозу исследуемого
вируса (4ГАЕ), исходя из его титра.
Для этого исходный вирус разводят физиологическим раствором
во столько раз, сколько получают от деления его титра на 4.
Например: титр вируса 1:256. Для приготовления рабочего раз-
ведения необходимо взять 63 см3 физиологического раствора и 1 см3
исходного вируса (256:4=64).
Объем рабочей дозы вируса определяют, исходя из количества
подлежащих исследованию сывороток. Для постановки РТГА микромето-
дом на исследование 1 сыворотки требуется 0,6 или 0,3 см3 4 ГАЕ
вируса (в зависимости от первоначального объма физиологического
раствора), макрометодом - 2,4 см3.
2.5.3. Рабочую дозу вируса готовят непосредственно в день
постановки реакции с обязательным контролем 4 ГАЕ.
Для этого в 4 лунки разливают физиологический раствор в объ-
емах, выбранных для постановки реакции. В первую добавляют равный
объем рабочей дозы вируса и титруют согласно п. 2.5.1.
Учет реакции проводят после оседания зритроцитов в контроле.
При правильном определении рабочей дозы в первой, второй
лунках должна быть полная агглютинация ("зонтик"), в третьей -
частичная, в четвертой - отсутствие агглютинации ("пуговка").
Полная агглютинация в третьей лунке означает, что доза вируса за-
вышена, а отсутствие агглютинации в первой или во второй лунках -
свидетельствует о недостаточном его количестве. Корректирование
рабочей дозы (увеличение или уменьшение) проводят добавлением ви-
руса или физиологического раствора с обязательным повторным конт-
ролем 4 ГАЕ.
2.6. Постановка РТГА.
2.6.1. Для постановки реакции во все лунки полистероловой
микро- или макропанели вносят физиологический раствор в объеме
0,05 (О,025) или 0,2 см3. Затем в первую лунку добавляют равный
объем испытуемой сыворотки, трижды пипетируют и готовят ряд пос-
ледовательных двукратных разделений (с 1:2 до 1:4096).
После этого, во все лунки вносят рабочее разведение вируса в
объеме 0,05 (0,025) маи 0,2 см3, осторожно встряхивают и после
25-30 мин контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют
двойной объем (по отношению к объему физиологического раствора)
суспензии эритроцитов.
2.6.2. Контроли:
- сыворотки на изоаггютинацию (сыворотка + физиологический
раствор в равных объемах + 1%-ная суспензия эритроцитов в двойном
объеме). Агглютинация должна отсутствовать;
- эритроцитов на спонтанную агглютинацию (суспензия эритро-
циты + физиологический раствор в равных объемах). Агглютинация
должна отсутствовать.
2.6.3. Реакцию учитывают через 25-40 мин. При наличии в сы-
воротке антител наблюдают торможение гемагглютинации - эритро-
циты выпадают в осадок в виде "пуговки".
Титром сыворотки считают наибольшее ее разведение, дающее
полное торможение гемагглютинации 4 ГАЕ вируса НБ.
2.7. Интерпритация полученных результатов.
2.7.1. По результатам РТГА определяют эффективность иммуни-
зации в партии привитых цыплят путем деления суммарного количест-
ва проб с титром антител 1:8 и выше (после применения живых вак-
цин) или 1:16 и выше (после применения инактивированных вакцин)
на общее число исследованных сывороток и выражают в процентах.
2.7.2. Птицу считают невосприимчивой к НБ при эффективности
иммунизации 80 и более процентов после применения живых вирусвак-
цин и 90 и более процентов после использования инактивированных
препаратов.
2.7.3. При эффективности иммунизации менее 80% после приме-
нения живых вирусвакцин или менее 90% после применения инактиви-
рованных вирусвакцин птица подлежит повторной вакцинации.
2.7.4. Обнаружение в РТГА высокого уровня антител (1:2048 и
выше у птиц, привитых живыми вакцинами, и 1:4096 и выше у птиц,
привитых инактивированными вакцинами) свидетельствует о возможной
циркуляции в стаде полевого вируса ньюкаслской болезни. В таких
случаях через 21-ЗО дней проводят повторное исследование проб сы-
вороток крови, полученных от этих же птиц.
2.7.5. Снижение или стабилизация уровня антител и (или)
уменьшение количества птиц с высоким уровнем антител при повтор-
ных исследованиях проб сыворотки крови свидетельтвует об отсутс-
твии циркуляции в хозяйстве эпизоотического вируса и является
следствием поствакцинальных реакций.
2.7.6. Нарастание титров и (или) увеличение количества птиц с
высоким уровнем антител при отсутствии клинических и патологоана-
томических признаков НБ не является основанием для объявления хо-
зяйства неблагополучным по данному заболеванию, но предусматривает
установление за птицей тщательного наблюдения, проведения система-
тических серологических и вирусологических исследований.
2.7.7. Нарастание титров и (или) увеличение количества птиц с
высоким уровнем антител при наличии клиникопатологоанатомических
признаков заболевания служит основанием для проведения детального
эпизотологического обследования хозяйства и установление оконча-
тельного диагноза по данному заболеванию.
2.7.8. Обнаружение антител к вирусу ньюкаслской болезни у
птиц, не привитых против НБ без клинических и патолоанатомических
признаков заболевания свидетельствует о циркуляции полевых ленто-
генных штамов вируса ньюкаслской болезни и не является основанием
для объявления хозяйства неблагополучным по НБ. За птицей таких
хозяйств устанавливают постоянное наблюдение.
С утверждением настоящих Методических указаний на территории
Российской Федерации отменяются Методические указания по серологи-
ческому контролю напряженности иммунитета при ньюкаслской болезни
птиц с помощью реакции задержки гемагглютинации N115-6а от 18.05.79г.
Методические указания по определению уровня антител к вирусу
ньюкаслской болезни в реакции тороможения гемагглютинации разрабо-
таны сотрудниками лаборатории препаратов. применяемых в птицеводст-
ве Всероссийского Государственного научно-исследовательского инсти-
тута контроля. стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.