МИНИСТЕРСТВО
 СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА 
РОССИЙСКОЙ  ФЕДЕРАЦИИ

ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ                               УТВЕРЖДАЮ
                                               Заместитель начальника
09.12.97г. N 13-4-2/1116                       Департамента ветеринарии
                                                   В.В.Селиверстов
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по определению патогенности аэромонад
по степенн ДНКазной активности

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1.1. Метод определения патогенности бактерий путем исследодания активности
бактериальных ферментов позволяет судить о потенциальной способности бактерий
вызывать патологический процесс.

1.2. Патогенность (вирулентность) аэромонад зависит от активности продуциро-
вання экстрацеллюлярных энзимов - факторов нестабильности, к которым относится и
ДНКаза (дезоксирибонуклеаза).

1.3. Определение ДНКазы используется как косвенный метод определения пато-
генности. Применение метода ДНКазной активности позволяет получить ответ через 48
часов.


2.ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Навеску ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) из расчета 200 мг/100
мл среды растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды,
подщелоченной 1N раствором NаОН , вносят в расплавленный мясо-пептонный
агар и стерилизуют однократно текучим паром 50 мин. Перед посевом агар
расплавляют и стерильно добавляют на каждые 100 мл среды 0,8 мл 10%-ного
СаСl . Расплавленный агар разливают в чашки Петри по 25 мл; после застывания
    2
агара чашки подсушивают в термостате.

2.1.1. Можно использовать готовую среду фирм Difсо или Gibсо.

2.2. Перед посевом дно чашки расчерчивают карандашом по стеклу на 6-16
секторов (радиальных или прямоугольных), в каждом секторе ставят
соответствующий порядковый номер.

2.3. Для посева используют суточную агаровую культура ИСПЫТЫВАЕМОГО
штамма. Посев производят уколом в центр сектора, не доводя петлю до дна
чашки. Для удобства обозначения каждую культуру условно нумеруют от
единицы и далее.

2.4. Чашки инкубируют при температуре 25-ЗО гр.С в течение 48 часов.

2.5. После инкубации на поверхность среды наносят 8-10 мл 1N раствора
НСl, чашки слегка покачивают для равномерного смачивания поверхности среды.
Через 10 мин, кислоту сливают и учитывают результат.

3. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Соляная кислота осаждает только полимерную ДНК, образуя
хлопьевидный преципитат, в результате чего среда становится матовой. ДНК,
деполимеризованная дезоксирибонуклеазой, продуцируемой бактериями, не
осаждается, и вокруг этих макроколоний образуются прозрачные зоны.

3.2. Ширина зоны деполимеризации зависит от степени ДНКазной
активности и измеряется миллиметровой бумагой от края макроколонии до конца
зоны просветления. Учет проводят в миллиметрах ширины зоны деполимеризации
или в четырехплюсовой системен + - зона деполимеризации до 2 мм,
                              ++ - зона деполимеризации 2-3 мм,
                             +++ - зона деполимеризации 3-5 мм,
                            ++++ - зона деполимеризации 5 мм и более.

3.3. Культуры аэромонад, выделенные из патматериала, дающие зону
деполимеризации до 2 мм - слабовирулентные, до 4 мм - вирулентные, более 4 мм -
высоковирулентные.

Методические указания разработаны лабораторией ихтиопатологии
Всероссийского научно-исследовательского института пресноводного рыбного
хозяйства.

С утверждением Настоящих Методических указаний утрачивают
силу "Методические указания по определению патогенности аэромонад по
степени ДНКазной активности", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 
8.05.87г.№432-5.