МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ Заместитель начальника 09.12.97г. N 13-4-2/1116 Департамента ветеринарии В.В.Селиверстов МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ по определению патогенности аэромонад по степенн ДНКазной активности 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 1.1. Метод определения патогенности бактерий путем исследодания активности бактериальных ферментов позволяет судить о потенциальной способности бактерий вызывать патологический процесс. 1.2. Патогенность (вирулентность) аэромонад зависит от активности продуциро- вання экстрацеллюлярных энзимов - факторов нестабильности, к которым относится и ДНКаза (дезоксирибонуклеаза). 1.3. Определение ДНКазы используется как косвенный метод определения пато- генности. Применение метода ДНКазной активности позволяет получить ответ через 48 часов. 2.ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Навеску ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) из расчета 200 мг/100 мл среды растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, подщелоченной 1N раствором NаОН , вносят в расплавленный мясо-пептонный агар и стерилизуют однократно текучим паром 50 мин. Перед посевом агар расплавляют и стерильно добавляют на каждые 100 мл среды 0,8 мл 10%-ного СаСl . Расплавленный агар разливают в чашки Петри по 25 мл; после застывания 2 агара чашки подсушивают в термостате. 2.1.1. Можно использовать готовую среду фирм Difсо или Gibсо. 2.2. Перед посевом дно чашки расчерчивают карандашом по стеклу на 6-16 секторов (радиальных или прямоугольных), в каждом секторе ставят соответствующий порядковый номер. 2.3. Для посева используют суточную агаровую культура ИСПЫТЫВАЕМОГО штамма. Посев производят уколом в центр сектора, не доводя петлю до дна чашки. Для удобства обозначения каждую культуру условно нумеруют от единицы и далее. 2.4. Чашки инкубируют при температуре 25-ЗО гр.С в течение 48 часов. 2.5. После инкубации на поверхность среды наносят 8-10 мл 1N раствора НСl, чашки слегка покачивают для равномерного смачивания поверхности среды. Через 10 мин, кислоту сливают и учитывают результат. 3. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ 3.1. Соляная кислота осаждает только полимерную ДНК, образуя хлопьевидный преципитат, в результате чего среда становится матовой. ДНК, деполимеризованная дезоксирибонуклеазой, продуцируемой бактериями, не осаждается, и вокруг этих макроколоний образуются прозрачные зоны. 3.2. Ширина зоны деполимеризации зависит от степени ДНКазной активности и измеряется миллиметровой бумагой от края макроколонии до конца зоны просветления. Учет проводят в миллиметрах ширины зоны деполимеризации или в четырехплюсовой системен + - зона деполимеризации до 2 мм, ++ - зона деполимеризации 2-3 мм, +++ - зона деполимеризации 3-5 мм, ++++ - зона деполимеризации 5 мм и более. 3.3. Культуры аэромонад, выделенные из патматериала, дающие зону деполимеризации до 2 мм - слабовирулентные, до 4 мм - вирулентные, более 4 мм - высоковирулентные. Методические указания разработаны лабораторией ихтиопатологии Всероссийского научно-исследовательского института пресноводного рыбного хозяйства. С утверждением Настоящих Методических указаний утрачивают силу "Методические указания по определению патогенности аэромонад по степени ДНКазной активности", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 8.05.87г.№432-5.