ПРАВИЛА
проведения работ в диагностических лабораториях,
использующих метод полимеразной цепной реакции
(основные положения)
1.Область применения
2.Требования к помещениям
3.Требования к инструментам и организация работы
4.Требования к проведению ПЦР-анализа
МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ
(Минсельхозпрод России) Начальник Департамента
ветеринарии
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ В.М.Авилов
27.01.97г. № 13-7-2/840
ПРАВИЛА
проведения работ в диаг-
ностических лабораториях,
использующих метод поли-
меразной цепной реакции
(основные положения)
1.Область применения
1.1.Данные Правила предназначены для ветеринарных учреждений,
использующих метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в целях диагнос-
тики инфекционных болезней.
1.2.Полимеразная цепная реакция является высоко чувствительным
специфическим методом.
1.3. Высокая чувствительность ПЦР обуславливает проблему возмож-
ной контаминации.
Попадание в реакционную пробирку следовых количеств ДНК или кДНК
возбудителя (специфических продуктов амплификации ДНК; ДНК-стандарта,
используемой в качестве положительного контроля; ДНК или кДНК возбуди-
теля клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР спе-
цифического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложно-положи-
тельных результатов.
1.4. Различают следующие виды контаминации.
1.4.1. Контаминация продуктами амплификации (ампликонов) имеет
наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР фрагменты ДНК накаплива-
ются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реам-
плификации.
1.4.2.Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе об-
работки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси),
приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов.
1.4.3. Контаминация посуды, автоматических пипеток и лабораторно-
го оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже кожи сот-
рудников лаборатории следовыми количествами ампликонов приводит к по-
явлению систематических ложно-положительных результатов.
Определить источник контаминации, как правило, бывает очень труд-
но и требует значительных затрат времени и средств .
1.5.В целях предотвращения ложно-положительных результатов при
использовании метода ПЦР, кроме обычных требований, предъявляют допол-
нительные требования к расположению помещений и проведению самих ана-
лизов.
2. Требования к помещениям.
2.1. Подразделение ПЦР-диагностики должно быть разделено на зоны
(комнаты).
2.1.1. Пре-ПЦР-помещение, в котором проводят обработку клиничес-
ких-образцов, выделение ДНК или РНК, приготовление реакционной смеси
для обратной транскрипции и ПЦР, постановку ПЦР. Пре-ПЦР-помещение
должно быть оборудовано ламинарным боксом.
2.1.2. При наличии условии приготовление реакционной смеси для
обратной транскрипции и ПЦР, постановку ПЦР рекомендуется проводить в
отдельном помещении или специальных ламинарах.
2.1.5. Пост-ПЦР-помещение, где проводят детекцию продуктов амп-
лификации.
2.2. Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение)
располагают как можно дальше от пре-ПЦР-помещения.
2.3. Необходимо исключить движение воздушного потока из пос-ПЦР
н пре-ПЦР-помещение.
2.4. Работа в лаборатории должна быть организована в одном нап-
равлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.
В пре- и пост-ПЦР-помещениях лаборатории должны работать разные
сотрудники.
2.5.В пре-ПЦР-помещении запрещается проводить все другие виды
работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие
диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностику которых проводят в дан-
ной лаборатории.
2.6. В пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы
исследований на инфекционные болезни, диагностика которых осуществля-
ется в данной лаборатории.
2.7. В комнате обработки клинических образцов и в комнате
приготовления реакционной смеси должны быть установлены настольные
боксы с ультрафиолетовыми лампами или ламинары.
2.8. Рабочие поверхности, оборудование и материалы облучают уль-
трафиолетовыми лучами с максимумом излучения в области 260 нм. Облуче-
ние проводят в течение 1ч. до начала работы и после ее окончания.
3.Требования к инструментам и организация работы
3.1.При исследовании материала, подозреваемого в заражении воз-
будителями инфекционных болезней I-II групп патогенности, работу необ-
ходимо проводить с соблюдением "Санитарных правил СП 1.2.011-94. Безо-
пасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности".
3.2. Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно
иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников,
пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и
перчаток, используемых только в данном помещении. Оборудование, мате-
риалы и инвентарь в каждом комнате должны иметь соответствующую марки-
ровку, выносить их в другие ПЦР-помещения запрещается.
Э.Э. Каждый сотрудник ПЦР-лаборатории должен иметь персональный
набор автоматических пипеток и реагентов.
3.4. Пробирки и наконечники для автоматических пипеток используют
однократно. При переходе от одной пробы к другой обязательно меняют
наконечники с целью предотвращения перекрестной контаминации в процес-
се выделения ДНК, РКН или при раскапывании реакционной смеси.
З.5. При обработке клинических образцов и внесении выделенной ДНК
или РНК в реакционную пробирку используют наконечники для автоматичес-
ких пипеток с аэрозольным барьером или наконечники с ватным фильтра-
ми, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК.
3.6. Работы в комнате обработки клинических образцов и в комнате
приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР проводят в перчатках,
которые используют однократно.
3.7.Обработку рабочей одежды из пре- и пост-ПЦР-помещений должны
проводить раздельно.
3.8. В работе следует использовать суховоздушные термостаты, ис-
пользование водяных бань запрещено, так как заполняющая их вода может
стать источником контаминации.
3.9. Санитарные требования:
- каждое помещение должно иметь отдельный набор инвентаря для об-
работки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет,
70%-ный этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.)и источники, ультрафио-
летового излучения;
- при манипуляции с клиническим материалом рабочую поверхность
столов до и после проведения исследований обрабатывают дезинфицирующим
раствором, применяемым при данной болезни, затем 70%-ным эталоном;
- в комнате изготовления реакционной смеси рабочую поверхность
перед работой обрабатывают 70%-ным эталоном.
3.10. К работе в ПЦР-диагностической лаборатории допускается пер-
сонал, прошедший соответствующее обучение.
4. Требования к проведению ПЦР-анализа.
4.1. Обработка клинических образцов.
4.1.1. Отбор клинических образцов необходимо проводить только в
одноразовые пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предвари-
тельно обработанные в течение 1 ч. хромовой смесью, тщательно промытые
дистиллированной водой и прокаленные.
4.1.2. Клинические образцы хранят отдельно от реагентов.
4.1.3. Работают с клиническими образцами только в одноразовых
перчатках.
4.1.4. Используют одноразовые наконечники для автоматических пи-
петок с аэрозольным барьером.
4.2. Постановка ПЦР.
4.2.1. Смесь реактивов для ПЦР готовят сразу на все пробы, вклю-
чая контрольные, и затем раскапывают ее по пробиркам.
4.2.2. Одновременно работают только с одной пробиркой.
4.2.3. При постановке ПЦР обязательно применяют отрицательный и
положительный контроли в соответствии с наставлениями по применению
диагностических наборов.
4.2.4. Подготовленные к ПЦР исследуемые образцы добавляют в реак-
ционные смеси в последнюю очередь одноразовыми наконечниками с аэро-
зольным барьером. Использованные наконечники сбрасывают в емкость с
1N-ным раствором HCI.
4.3. Детекция продуктов амплификации.
4.3.1. Анализ продуктов ПЦР проводят в изолированной комнате.
4.3.2. Оборудование, реактивы, халаты, перчатки, а также убороч-
ный инвентарь, используемые в комнате детекции продуктов амплификации
(пост-ПЦР-помещение), должны находиться только в этой комнате и не по-
падать в пре-ПЦР-помещения.
4.3.Э.В дополнение к общим требованиям в комнате детекции про-
дуктов амплификации необходимо работать в сменной обуви.
4.3.4. Детекцию продуктов амплификации должен проводить сотрудник
лаборатории, не занятый обработкой клинических образцов и операциями с
реакционной смесью.
4.3.5.Использаванные наконечники для автоматических пипеток, раз-
ной цепной реакцией, но и другими методами диагностики данной инпро-
бирки и другие загрязненные ДНК материалы обрабатывают реагентами, фек-
ции, вызывающими деградацию ДНК (1 N-ый раствор HCI, 10%-ый раствор
гипохлорида натрия 10%-ый раствор хлорной извести).
4.4.Для оценки качества работы ПЦР-диагностической лаборатории
периодически применяют внутрилабораторные контрольные положительные и
отрицательные образцы, охарактеризованные не только с помощью полиме-
разной цепной реакции, но и другими методами диагностики данной инфек-
ции.
Правила разработаны Всероссийским государственным научно-исследо-
вательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветери-
нарных препаратов и Всероссийским научно-исследовательским институтом
защиты животных.
Начальник отдела ветсанэкспертизы
и лабораторной диагностики Б.И.Антонов