Методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов с клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе 1. Общие положения 2. Приготовление препаратов бактерий для изучения адгезивных свойств бактери и на эритроцитах млекопитающих 3. Исследование препаратов в световом микроскопе 4. Исследование препаратов с помощью сканирующего электронного микроскопа МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОСCИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (Минсельхозпрод России) ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ Заместитель руководителя Департамента ветеринарии № 13-7-2/4 от 16 Февраля 1999 г. В.В.Селиверстов Методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов с клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе 1. Общие положения Профилактика общих для человека и животных болезней, а также знание патогенеза, иммуногенеза этих болезней требуют детального изучения колонизирующих свойств бактерий, так как колонизация - естественная форма существования сапрофитов, условно-патогенных и патогенных бактерий и колонизирующая способность микроорганизмов во многом определяется процессом адгезии . Общеизвестно, что одним из перспективных методов предотвращения колонизации in vivo (макроорганизм) и in vitro (пищевые продукты, корма) патогенными и условно-патогенными бактериями является конкурентное замещение микробами- антагонистами, обладающими более выраженными адгезивными свойствами. В этой связи модификации методов исследования адгезивных свойств бактерий является актуальной задачей ветеринарной медицины и открывает перспективу создания анти микробных препаратов по предотвращению адгезии, а следовательно и колонизации. Для более объективной оценки механизма взаимодействия адгезинов бактерий с рецепторами животных клеток (эритроцитов, гепатоцитов, энтероцитов и др.) предлагается метод приготовления препаратов, исключающих нанесение жидких фиксаторов и гистологических красителей, что позволяет исследовать межпопуляционное взаимодействие без нарушения естественной архитектоники. Предлагаемый метод можно использовать при более глубоком изучении адгезивного процесса, например, при исследовании влияния различных абиотических (температуры, рН среды, ультрафиолетового облучения и др.), биотических (штаммы- антагонисты, простейшие и др.) и антропогенных факторов (дезинфицирующих средств, антибиотиков и др.) на указанный процесс. 2. Приготовление препаратов бактерий для изучения адгезивных свойств бактери и на эритроцитах млекопитающих Готовят бактериальную взвесь изучаемого микроорганизма в концентрации 1 млрд/мл и взвесь эритроцитов в концентрации 1млн/мл. Сливают равные объемы указанных взвесей в пробирки и помещают их на встряхивателе при 37 гр.С на 30 минут. Готовят мазки крови на предметных (для световой микроскопии) и покровных (для электронной микроскопии) стеклах. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят небольшую каплю крови, затем шлифованным стеклом легким и быстрым движением равномерно распределяют кровь по предметному стеклу. Готовый, правильно приготовленный, мазок имеет желтоватый цвет. Таким же образом готовят мазок на покровном стекле. Предметные и покровные стекла помещают в чашки Петри и фиксируют парами 25 %-го глутарового альдегида в течение 30- 40 мин, для дополнительного контрастирования проводят обработку парами 1-2 %-го водного раствора четырехокиси осмия в течение 3-5 мин. 3. Исследование препаратов в световом микроскопе После обработки эритроциты и бактерии окрашиваются в светло-коричневый цвет. При этом готовые препараты получаются контрастными, артефактов не наблюдается и сохраняется архитектоника взаимодействия бактериальных и животных клеток . Для подсчета степени адгезии изучаемого микроорганизма препараты исследуют под световым микроскопом. На предметных стеклах подсчитывают число адгезированных бактериальных клеток на 30 эритроцитах и определяют средний показатель адгезии (СПА). СПА оценивают по показателям: при адгезии от О до 1,00 клеток - СПА считают нулевым, от 1,01 до 2,0 - низким, от 2,01 до 4,0 - средним, от 4,0 и выше - высоким, соответственно испытуемые культуры микроорганизмов относят к неадгезивным, низкоадгезивным, среднеадгеэивным, высокоадгезивным. 4. Исследование препаратов с помощью сканирующего электронного микроскопа Для исследования в сканирующем электронном микроскопе препараты на покровных стеклах просматривают под световым микроскопом, затем откалывают маленький кусочек покровного стекла, который был отмечен при просмотре в световом микроскопе, и помещают его на объектдержатель. Препараты напыляют золотом или платиной на напылительной установке и просматривают участки препаратов на сканирующем электронном микроскопе. Использование сканирующего электронного микроскопа позволяет детально изучать механизм взаимодействия адгезинов бактериальной клетки с рецепторами животных клеток. Методические рекомендации разработаны: Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (И.Б.Павлова), Московским государственным университетом прикладной биотехнологии (Е.М.Ленченко, М.Ю.Штукарева), департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России (В.И. Белоусов).