"УТВЕРЖДАЮ"
                                                                                                              Начальник Росгоскарантина

                                                                                                              А.С.Васютин
                                                                                                              " 12 " октября 1999 г.

Разработаны:
Орлинский П.Д., Кулинич О.А.

Распространение
Экономический ущерб
Биология
Методы сбора, выделения, хранения и культивирования нематод

• Обследование лесонасаждений
• Обследование лесоматериалов на складах и в портах
• Методы выделения нематод
• Метод Бермана
• Фиксация
• Хранение материала
• Культивирование нематод

Таксономия и идентификация нематод

Кроме Японии на азиатском континенте вид В.xylophilus обнаружен на Тайване и
Южной Корее, широко распространен в Юго-Восточной части Китая. В Северной
Америке вид В.xylophilus широко распространен в лесах США и южных
провинциях Канады. Имеется информация об обнаружении данного вида в Мексике.

Обследование лесов на наличие В.xylophilus, проведенное в большинстве стран Европы,
показало отсутствие B.xylophilus на территории этих стран, но присутствие морфологически
близкого вида В. mucronatus.

В России специальные исследования лесонасаждений на зараженность B.xylophilus
проводились в различных регионах страны (Приморский край, Западная Сибирь,
Урал, Европейская часть России). При этом был повсеместно обнаружен
только вид нематоды В. mucronatus.

                                                                                 Экономический ущерб

Вред, наносимый нематодой B.xylophilus хвойным породам, весьма существенен.
Наглядно это видно на примере Японии. В 80-х годах потери строевого леса
от болезни, вызванной B.xylophilus
составили 1,5-2 млн.куб. м.

Начиная с 1986 г. большинство стран ЕС ввели ограничения на импорт древесины
хвойных пород из регионов, где распространена нематода B.xylophilus. Введение
странами-импортерами эмбарго на поставки древесины и древесных продуктов
из США и Канады, где обнаружена B.xylophilus, принесло убытки компаниям,
экспортирующим лес, в десятки млн. долларов. В настоящее время сосновая
древесная нематода B.xylophilus внесена в списки карантинных объектов многих
стран мира, включая Россию.

                                                                                              Биология

Жизненный цикл сосновой древесной нематоды1 B.xylophilus тесно связан с
насекомыми, которые переносят ее с одного дерева на другое (рис. 1, 2).
Основными переносчиками B.xylophilus являются усачи рода Monochamus:
Monochamus alternatus в Японии и M.carolinensis - в США. В то же время
сосновую древесную нематоду обнаруживали и в других насекомых - златках,
долгоносиках. Цикл развития B.xylophilus проходит следующим образом: ранним
летом молодые имаго усача, несущие B.xylophilus, выходят из древесины погибшего
дерева и заселяют здоровые деревья, где в течение 3-4 недель происходит их
дополнительное питание на молодых веточках. В этот период происходит выход
нематод из насекомого. Через раны, нанесенные жуками, нематоды проникают в
древесину здорового дерева. Питаясь на эпителиальных клетках смоляных каналов,
нематоды, при благоприятных условиях, быстро размножаются и расселяются по
всему дереву. Пораженные нематодами ветки усыхают. После дополнительного
питания самки жуков откладывают яйца на ослабленные или погибшие деревья,
где также происходит переход нематод из жуков в древесину. Отродившиеся из яиц
личинки жуков проникают под кору дерева, где проходят питание, а в конце своего
развития делают пупальную колыбельку, в которой происходит окукливание.
Заражение насекомых нематодами происходит перед выходом имаго из куколки.
Нематоды заселяют как наружные, так и внутренние органы насекомого, концентрируясь,
главным образом, в дыхальцах жуков. В дальнейшем цикл развития повторяется.

В своем развитии, от яйца до имаго, B.xylophilus проходит четыре личиночных стадии.
Развитие осуществляется двумя путями (рис.1), существенно отличающимися друг от
друга - с участием насекомых (дисперсионный путь) и без них (генеративный).

Генеративный путь развития начинается весной и продолжается в течение всего
периода вегетации растений. При благоприятных условиях развитие сосновой
древесной нематоды, от яйца до имаго, завершается за 5 дней. Данный путь
развития происходит после выхода нематод из жуков во время их дополнительного
питания на веточках здоровых деревьев. В результате фитофагии, а за тем микофагии
(на грибах Botrytis, Ceratocystis, содержащихся в мертвой древесине), нематоды
быстро размножаются, и численность их резко увеличивается.

Параллельно генеративному пути развития, в сильно пораженных нематодами
погибающих деревьях (или бревнах) идет и дисперсионный путь развития.
Особенность его в том, что после линьки личинки 2-го возраста, образуется
дисперсионная личинка 3-го возраста, морфологически и физиологически
отличающаяся от личинки подобного возраста при генеративном пути развития.
Дисперсионная личинка очень устойчива к различным неблагоприятным
факторам: низким температурам, дефициту пищи и влаги. Зимует сосновая
древесная нематода в стадии дисперсионной личинки.

К концу зимы нематоды линяют и дисперсионная личинка преобразуется
в 4-ю стадию, получившую название дауэрлярва (dauerlarvae) или
трансмиссионная личинка. Время образования этой личинки связано с появлением
в куколке насекомого молодого имаго. Трансмиссионные личинки, адаптированные
физиологически к жуку-переносчику, проникают через его дыхальца и расселяются
по всему телу насекомого, но концентрируются в большей численности в трахейной
системе. В дальнейшем, при питании жуков на молодых веточках хвойных растений,
нематоды покидают тело жука и попадают в здоровые деревья (рис.1, 2).

                                                  Методы сбора, выделения, хранения и культивирования нематод
                                                                   
                                                      (Иллюстрации метода выделения нематод приве-
                                                       дены в “Фотоальбоме вредителей леса, имеющих
                                                       карантинное значение для России и других стран”).

1. Обследование лесонасаждений. Для определения зараженности лесонасаждений
хвойных пород нематодами рода Bursaphelenchus, исследуют как погибшие
деревья, так и деревья на всех стадиях усыхания. Пробы древесины берут со стволовой
части, на значительном расстоянии от комля и усыхающих веток 1-2-го порядков.
Особый интерес представляют участки древесины с ходами жуков рода Monochamus
и ветки со следами их дополнительного питания. Из стволовой части и веток выпиливают
участки древесины толщиной 2-5 см или вырубают топором кусок древесины размером
приблизительно 10х10 см.

При взятии проб буром, содержимое помещается в бумажный конверт. На взятом
куске древесины (или пакетике с керном) ставят пометку (номер или краткую
информацию), а в рабочем журнале делают запись о взятии пробы на нематод.

Следует отметить, что чем больше объем куска древесины, тем больше вероятность
сохранения в нем живых нематод. Обследованию на зараженность нематодами подлежат
опилки, стружки, доски и другие лесоматериалы. Обследуются также сортименты,
находящиеся на нижних и верхних складах лесоматериалов, а также поваленные деревья
и порубочные остатки в лесонасаждениях.

По этим же деревьям определяется видовой состав стволовых вредителей.

Анализ деревьев, поваленных или срубленных в текущем году, проводится в июле-
августе, когда произошла откладка яиц усачами, а деревьев, поваленных или
срубленных в прошлом году, можно проводить в течение всего вегетационного периода.

Помимо исследования древесины на нематод, возможно использование жуков-усачей
рода Monochamus. Сбор насекомых проводится традиционными методами, принятыми
в энтомологии. Нематоды из насекомых также выделяются методом Бермана. Перед
тем, как положить жуков на сито в воронку, их необходимо препарировать скальпелем
или разрезать на кусочки ножницами.

В случае обнаружения нематод рода Bursaphelenchus, материал с нематодами
отправляется на подтверждение во ВНИИКР. Пробы транспортируют в бумажных
или пластмассовых пакетах, или в небольших контейнерах.

В случае обнаружения насаждения, в котором имеются усыхающие деревья с
признаками поражения сосновой древесной нематоды, необходимо равномерно
по площади отобрать 10 модельных деревьев с наиболее типичными признаками.
Деревья необходимо повалить, и в первую очередь оценить наличие признаков
поражения их вредителями или возбудителями болезней лесных пород.
Обследование проводится с привлечением инженера-лесопатолога и специалистов
из местной службы защиты леса. После оценки всех возможных факторов,
приведших к усыханию деревьев, отбираются пробы с поваленных деревьев,
из срединной и вершинной части ствола. Далее в лабораторных условиях следует
произвести выделение и определение нематод по описанной методике.

В случае нахождения нематоды Bursaphelenchus xylophilus, и подтверждения
диагностики специалистами ВНИИКР, на район ее обнаружения накладывается
карантин. Извещаются карантинные инспекции регионов, в которые произведена
отправка лесоматериалов в текущем году; отправка лесоматериалов из района
допускается только после окорки, а также сушки по методу Kiln-drying или
фумигации.

В регионах, куда поступили лесоматериалы из зараженного района, карантинные
инспекции должны отследить все поступившие оттуда лесоматериалы, отобрать из
них древесные пробы, и, в случае обнаружения нематоды Bursaphelenchus xylophilus,
подвергнуть эти лесоматериалы уничтожению, либо обработке методам тепловой
сушки (Kiln-drying) или фумигации. Кроме того, необходимо проверить на сосновую
древесную нематоду находящиеся рядом хвойные насаждения и склады лесоматериалов.

Для проведения обследований, как в районе первичного обнаружения В.xylophilus, так и
в районах, куда могла поступить зараженная лесопродукция, необходимо вызвать
сотрудников отделов лесного карантина ВНИИКР и карантинного фитосанитарного
контроля лесных ресурсов Росгоскарантина.

2. Обследование лесоматериалов на складах и в
портах. При обследовании пиломатериалов (штабелей досок, поддонов, упаковочных
ящиков) на нематод рода Bursaphelenchus на складах и в портах отбираются пробы
10х5х5 см. в местах, содержащих личиночные ходы стволовых вредителей, или же
имеющих признаки поражения деревоокрашивающими грибами (синева древесины
и проч.). Особое внимание следует обратить на наличие ходов оставленных жуками-
усачами рода Monochamus: летные отверстия, ходы личинок. Это крупные отверстия
диаметром более 3 мм. Взятие древесных проб в которых имеются ходы жуков рода
Monochamus существенно увеличивает вероятность нахождения нематод в этих
образцах, т.к. нематоды, переносясь жуками, концентрируются в большей степени
вокруг ходов усачей.

· Если на упаковочном материале встречаются ходы насекомых или следы дерево-
окрашивающих грибов, необходимо отобрать по одной пробе от каждой 10-й единицы
партии (поддона, коробки, и проч.).

· В случае полного отсутствия признаков поражения древесины насекомыми или грибами,
достаточно отобрать 2-3 пробы от всей партии, выбирая самые низкокачественные
участки древесной поверхности.

· Для досмотра отбираются древесные пробы, в первую очередь - с участков ствола,
имеющих признаки поражения усачами и деревоокрашивающими грибами.

· Пробы отбираются из каждого 5-го бревна при партии до 50 бревен, и из каждого
10-го при большей партии. Если лесоматериалы представлены пиломатериалами
в упаковке, то пробы берутся от каждого пакета.

· Лесоматериалы и тара, подвергшиеся термообработке, или фумигации, не обследуются
на зараженность нематодами Bursaphelenchus spp.

3. Методы выделения нематод. Взятые древесные пробы измельчают топором на
щепу, которую затем разрезают секатором на мелкие кусочки.

Перед выделением нематод кусочки древесины взвешивают с целью дальнейшего
пересчета выделенных нематод в 1 г. Выделение нематод проводится методом
Бермана (см. ниже).

Из свежих пиломатериалов нематоды могут выделяться сразу. Если исследуются
поддоны, доски упаковочных ящиков, то целесообразно инкубировать такую
древесину в термостате, т.к. нематоды в такой высохшей древесине мало
и находятся они в 3-й устойчивой личиночной стадии. В связи с этим
необходимо их размножить. Для этого мелкие кусочки древесины, разрезанные
секатором, кладут в контейнер с герметично закрывающейся крышкой, который
помещают в термостат при темперауре 25-2б°С на 6 дней. Кусочки древесины
необходимо немного смочить водой. Далее нематод из древесины выделяют по
методу Бермана (см.. “Фотоальбом вредителей леса, имеющих каран-
тинное значение для России и других стран”).

4. Метод Бермана. На горло воронки надевают резиновую трубку соответствующего
диаметра и длиной 4-5 см. В другой конец трубки вставляют небольшую пробирку.
В воронку помещают металлическое сито и марлю для того, чтобы кусочки
ткани не тонули и не забивали отверстие воронки. Далее следует смочить сетку водой,
чтобы под ней в дальнейшем не образовался воздушный пузырь, и поместить на нее
расщепленные и измельченные секатором кусочки древесины. Воронку заполняют
водой до уровня несколько выше сетки. Время экспозиции тканей в воде - 12 часов
при комнатной температуре.

Хранение нематод возможно двумя способами: в фиксированном виде или в живом
(в культуре).

5. Фиксация. Фиксируют нематод раствором формалина, добавляя его в пробирку
в таком количестве, чтобы общая концентрация суспензии с нематодами
составляла 4-5%. Хорошим фиксатором для нематод является раствор ТАФ
(формалин 7 мл, триэтаноламин 2 мл, дистиллированная вода 91 мл). Для получения
в дальнейшем более качественных препаратов с нематодами, пробирку с ними (а
также пузырек с формалином или ТАФ) перед фиксацией желательно подогреть по
методу водяной бани до 45-50° С.

6. Хранение материала. Для лучшего сохранения нематод в древесине, пробы
необходимо в полевых условиях хранить в прохладном, темном месте,
с целью избежания их высыхания. В лаборатории наилучшим местом хранения
является холодильник с температурой +5-+10⁰ С. Не желательна также
чрезмерная влажность, т.к. это способствует развитию плесневых грибов.
В хорошо сохраняемом куске древесины нематоды могут существовать
в течение многих месяцев.

В фиксированном виде в пробирке материал может храниться долго (в течение
многих лет).

7. Культивирование нематод. Идентификация нематод рода Bursaphelenchus
крайне затруднена, и при их определении часто требуется наличие живых
особей. Кроме того, в насекомых обычно содержатся в массе трансмиссионные
личинки 4-го возраста (dauerlarvae), морфологически существенно отличающиеся
от всех других стадий B.xylophilus. Определение нематод до вида проводится
только по самцам и самкам. В связи с этим желательно размножить и сохранить
нематод для дальнейшего их изучения. К наиболее простым методам
размножения нематод рода Bursaphelenchus можно отнести метод культивирования
их на фитопатогенных грибах и метод размножения в кусках древесины
хвойных пород.

В качестве субстрата для размножения нематод используют культуры фитопатогенных
грибов родов Botritys, Fusaruim, Alternaria, Ceratocystis. Грибы выращивают по
методикам, принятым в фитопатологии, на твердых питательных средах: сусле-агаре,
картофельном агаре и других. При полном зарастании питательного субстрата мицелием
грибов, туда помещают нематод. После накопления в достаточной численности нематод
на грибном субстрате, их вместе с этим субстратом можно поместить в холодильник
на длительное хранение при температуре 4-10°С. Данный метод культивирования
несколько сложней последующего, но является более надежным для сохранения нематод.

Другим методом размножения нематод рода Bursaphelenchus является метод
культивирования их в древесных спилах хвойных пород. Ствол или толстые ветки
живого дерева в диаметре менее 10 см распиливают на участки (спилы) длиной
4-6 см. Торцевые концы парафинируют, опуская их в расплавленный парафин.
В боковой поверхности высверливают тонким сверлом отверстие, в которое
вносят суспензию нематод. Отверстие закрывают расплавленным парафином.
Следует отметить, что нематоды вида B.xylophilus предпочитают для размножения
температуру 30-33° С, B.mucronatus - 20-26° С, а наилучшим субстратом для культиви-
рования обоих видов нематод является сосна обыкновенная Pinus sylvestris.

Таксономия и идентификация нематод
Вид:

Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer, 1934)
Nickle, 1970
Систематическое положение:

Nematoda: Aphelenchoididae
Синонимы:

Aphelenchoides xylophilus Steiner & Buhrer
Bursaphelenchus lignicolus Mamiya & Kiyohara
Русское название:

сосновая древесная нематода
Английское название:

pinewood nematode, pine wilt disease

Известно 4 вида нематод морфологически близких к виду Bursaphelenchus xylophilus.
Это виды: B.xylophilus, B.mucronatus, B.fraudulentus и B.kolymensis.

Вид B.fraudulentus обитает в древесине лиственных пород, а вид B.kolymensis
согласно нашим исследованиям может рассматриваться синонимом вида B.mucronatus.

Таким образом, при анализе проб нематод из хвойных пород, необходимо различать
два вида B.xylophilus и B.mucronatus.

Идентификация. Определение нематод проводится с помощью микроскопа на временных
и постоянных препаратах, приготовленных из фиксированного материала
стандартными методами, принятыми в нематологии. Для определения нематод до отряда,
семейства и рода можно использовать определительные ключи имеющиеся в монографиях
(Кирьянова, Кралль, 1969, Кулинич,1990)

Ниже даны основные отличительные признаки, характерные для нематод, близких к виду
B.xylophilus (табл 1, 2, рис. 3-5).

     Основные морфометрические и аллометрические
                                 признаки нематод,
                близких к Bursaphelenchus xylophilus

                                                                                       Таблица 2

       Распространение и морфологические особенности
           нематод, близких к Bursaphelenchus xylophilus

Следует отметить, что вид B.fraudulentus встречается на лиственных породах,
остальные виды - на хвойных. Основным отличительным признаком вида
В. mucronatus, распространенного на территории России, от вида B.xylophilus,
встречающегося в Восточной Азии, является наличие мукро на конце хвоста
самок В.mucronatus.

          _{Вид B.fraudulentus               Виды B.xylophilus и B.mucronatus}
                                                                           

                    _{Древесина из        Древесина из     Древесина из других
             Cеверной Америки      Японии, Китая,    стран Азии и Европы
        (Канада, США, Мексика)   Южной Кореи      Хвосты самок нематод:
          Хвосты самок нематод:   Хвосты самок           B.mucronatus
                 B.xylophilus              B.xylophilus
                                                B.mucronatus}